השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

מאמר זה מתאר כיצד ליצור ריאות עכבר מהונדסות ביולוגית באמצעות שיטות דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה. הוא גם מפרט השתלת ריאות אורתוטופית לאחר מכן.

השתלת ריאות היא טיפול קריטי לחולים עם מחלות ריאה סופניות כמו פיברוזיס ריאתי אידיופטית, אך אתגרים כמו מחסור בתורמים וסיבוכים לאחר ההשתלה נמשכים. ריאות מהונדסות ביולוגית, המשלבות תאים ספציפיים לחולה בפיגומי בעלי חיים נטולי תאים, מהוות אלטרנטיבה מבטיחה. למרות ההתקדמות בשימוש בריאות מהונדסות ביולוגית במודלים של בעלי חיים, הפונקציונליות והמבנה נותרו לא בשלים. פרוטוקול זה מטפל במחסום קריטי בביו-הנדסה של איברים: הצורך בפלטפורמה ניסויית חסכונית. על ידי שימוש במודלים של עכברים במקום בעלי חיים גדולים יותר כמו חולדות או חזירים, חוקרים יכולים להפחית משמעותית את המשאבים הנדרשים לכל ניסוי, ולהאיץ את התקדמות המחקר.

הפרוטוקול מתאר נוהל מפורט לביו-הנדסה ריאתית באמצעות בלוקים של לב-ריאה של עכבר ותאים ראשוניים אנושיים, תוך התמקדות באסטרטגיית בידוד עבור בלוק לב-ריאה של עכבר, דה-סלולריזציה, הגדרת ביו-ריאקטור, תרבית איברים מבוססת זלוף והשתלה אורתוטופית של ריאות מהונדסות ביולוגית. פלטפורמה זו בקנה מידה עכבר לא רק מפחיתה את עלויות הניסוי אלא גם מספקת מסגרת בת קיימא לאופטימיזציה של סוגי תאים ומספרים לרסלולריזציה, בדיקת סוגי תאים שונים בשיטות היסטולוגיות ומולקולריות והבטחת זרימת הדם לאחר ההשתלה. השיטה טומנת בחובה פוטנציאל ליישומים רחבים, כולל חקר אינטראקציות בין תאים בתנאי תרבית תלת מימדית, אינטראקציות בין תא למטריצה ומודלים של סרטן מחוץ לגוף , ובכך לקדם את תחום הביו-הנדסה של איברים.

השתלת ריאות הייתה התרופה המכרעת לחולים הסובלים ממחלת ריאות סופנית¹ כגון פיברוזיס ריאתי אידיופטית, כאשר טיפול תרופתי אינו יעיל לעצירת הידרדרות תפקוד הנשימה. יותר חולים זכאים מצטרפים לרשימת ההמתנה מדי שנה; עם זאת, מספר תרומות האיברים מתורמים שנפטרו נגרר אחרי המספר ההולך וגדל של חולים ממתינים ^2,3. גם לאחר שעברו השתלת ריאות, לא מעט בעיות יפגעו בתפקוד הריאות המושתלות, כולל תפקוד לקוי של איברים ראשוניים, תסמונת אלוגנית תגובתית וזיהומים, מה שמפחית משמעותית את ההישרדות של 5 שנים של מושתלי ריאות⁴.

קיימות מספר אפשרויות להתמודד עם הבעיות הנוכחיות בהשתלת איברים, כולל ניצול תורמים שוליים⁵, התאוששות ריאות התורם במערכת זלוף ריאות ex vivo ⁶, והשתלת זרעים באמצעות חזירים ערוכים גנטית⁷. חלופות אלה יכולות להרחיב את מאגר האיברים התורמים; עם זאת, אף אחד מהם לא יכול לטפל לחלוטין במחסור, באימונוגניות ובהטרוגניות התפקודית של האיברים התורמים.

זה רחוק מהמציאות, אבל איברים מלאכותיים מהונדסים ביולוגית שבהם משולבים תאים ספציפיים לחולה בפיגום איברי בעלי חיים נטול תאים הם מקור פוטנציאלי מרתק להשתלת איברים מוצקים⁸. מספר מחקרים חלוציים שהדגימו את התועלת הפוטנציאלית של ריאות מהונדסות ביולוגית דווחו מאז 2010 ^9,10. במחקרים אלה, ריאות של חולדות או חזירים עברו דה-סלולריזציה על ידי חומרי ניקוי, תאים של בעלי חיים או בני אדם הוזרקו מקנה הנשימה או מכלי הדם הריאתיים כדי לחדש את רקמת הריאה בביו-ריאקטור מבוסס פרפוזיה, וחלקם הושתלו אורתוטופית בחללי בית החזה של בעלי החיים 11,12,13,14,15. עם זאת, התפקוד והמבנה של הריאות המהונדסות ביולוגית היו מוקדמים, ככל הנראה בגלל מספר לא מספיק של תאים שגודלו בביו-ריאקטור או צמתים בין-תאיים פחות משולבים.

מכשול אחד לקידום המחקר בביו-הנדסה של איברים הוא היעדר פלטפורמה ניסויית בקנה מידה קטן. בעוד שחולדות או חזירים הם בעלי החיים הנפוצים בתחום זה, הם דורשים >10⁸ תאי ריאה לריאה¹⁶, דבר היקר מאוד למעבדות אקדמיות. אם עכברים יהיו זמינים למחקר ביו-הנדסי של איברים, נוכל להפחית באופן דרמטי את העלות של כל ניסוי ולהאיץ את תוכנית המחקר. למרות שקיימים הבדלים אנטומיים בין ריאות עכבר לריאות אנושיות¹⁷, הארכיטקטורה הבסיסית של הריאה דומה בין יונקים¹⁸. לכן, התוצאות של ניסויים בקנה מידה עכבר יכולות לחול על חיות גדולות יותר פשוט על ידי הכפלת המספר בהתאם לגודל הגוף.

פרוטוקול זה נועד לתאר את ההליך הניסויי המפורט של ביו-הנדסה ריאתית באמצעות בלוקים של לב-ריאה של עכבר ותאים ראשוניים אנושיים¹⁹. אימצנו פרוטוקול דה-סלולריזציה של ריאות עכברים שדווח בעבר ונמצא בשימוש נרחב עבור מחקר זה 20,21,22. החלק המאתגר בביו-הנדסה ריאתית הוא התאיות מחדש של כלי הדם הנימים הנטולי תאים²⁰; לכן, תאי אנדותל של וריד חבל הטבור האנושי ישמשו בפרוטוקול זה.

כל הניסויים נערכו בהתאם לתקנות לניסויים בבעלי חיים ופעילויות קשורות באוניברסיטת טוהוקו (מהדורה¹⁵ ), שפורסמו על ידי אוניברסיטת טוהוקו²³. מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טוהוקו (#2020AcA-041-01).

1. הכנת חומרים לדה-סלולריזציה

1. הכנת תמיסות דה-סלולריזציה (פורמט 1,000 מ"ל בבקבוק זכוכית 1 ליטר)
   1. מים סטריליים נטולי יונים (DI): הוסיפו 1,000 מ"ל מים מזוקקים או DI לבקבוקי זכוכית הניתנים לחיטוי בנפח 1 ליטר. חיטוי למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.
   2. Triton X-100: הוסף 1 מ"ל של Triton X-100 ל-1,000 מ"ל של מי DI סטריליים בבקבוק זכוכית הניתן לחיטוי בפורמט 1 ליטר. (אופציונלי) הוסף 10 מ"ל של תמיסת פניצילין וסטרפטומיצין (ריכוז סופי, 500 יחידות/מ"ל של פניצילין ו-500 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין).
      הערה: אין לבצע חיטוי.
   3. נתרן דאוקסיכולאט: הוסף 20 גרם של אבקת נתרן דאוקסיכולט ל-1,000 מ"ל של מי DI סטריליים בבקבוק זכוכית הניתן לחיטוי בפורמט 1 ליטר. סגרו את הפקק והפכו את הבקבוק כדי להמיס את האבקה. (אופציונלי) הוסף 10 מ"ל של תמיסת פניצילין וסטרפטומיצין.
      הערה: אין לבצע חיטוי.
   4. 1 M NaCl: הוסף 58.44 גרם NaCl ל-1,000 מ"ל מים מזוקקים או DI בבקבוק זכוכית הניתן לחיטוי בפורמט 1 ליטר. חיטוי למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.
   5. תמיסת מלאי DNase I: לדלל בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל במדיום A.
      1. בינוני A: הכן 5 מ"מ CaCl₂ (5 מ"ג CaCl₂ ב-9 מ"ל של מי DI סטריליים) ודילול של 1:10 עם מי DI סטריליים.
   6. פתרון עבודה DNase I: הוסף 33 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DNase I ל-10 מ"ל של Medium B.
      1. בינוני B: הכינו 10x Medium B (155 מ"ג MgSO₄ + 220 מ"ג CaCl₂ ב-100 מ"ל של מי DI סטריליים) ודילול 1:10 עם מי DI סטריליים.
2. הכנת הצנתרים לעורק הריאה (PA) ולקנה הנשימה (פרוצדורה סטרילית)
   1. חותכים את קטטר ה-PA (קטטר לווריד הצוואר של חולדה) באורך של כ-15 מ"מ.
   2. העבר את הצווארון לקצה הקטטר.
   3. הכנס מחבר קטטר לתוך קטטר PA וחבר אותו למזרק. צנתרי PA מוכנים מוצגים באיור 1A.
   4. אחסן את קטטר הרשות הפלסטינית באתנול 70% עד לשימוש.
   5. חותכים את קטטר 20 G i.v. באורך של כ-15 מ"מ. זה משמש לצנתר קנה הנשימה.
3. ניתוח עכבר לקצירת גוש לב-ריאה
   1. המתת חסד של עכבר זכר (C57BL/6, משקל > 28 גרם) עם מנת יתר של פחמן דו חמצני או איזופלורן.
   2. הניחו את העכבר במצב שכיבה על שולחן כירורגי וקבעו את הגפיים. יש לעקר על ידי ריסוס אתנול 70% על פני החזה והבטן.
   3. פתח את חלל הבטן בקו החציוני לצוואר בעזרת מספריים אל חלד ופצל את עצם החזה עם המספריים. כרתו את הסרעפת מדופן בית החזה, חתכו את דופן בית החזה הגחוני כדי לחשוף את חללי בית החזה במלואם והסירו את התימוס. קשרו את הווריד הנבוב התחתון ואת הווריד הנבוב העליון הימני עם משי 4-0 כדי למנוע רגורגיטציה של PBS בשלב 1.3.5, ובכך לשפר את שטיפת הדם בכלי הדם הריאתיים.
   4. חותכים את אבי העורקים הבטני במספריים אל חלד לניקוז. אם לא ניתן להבחין באבי העורקים הבטני, חתכו לחלוטין את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים הבטני.
   5. הזריק 3 מ"ל של PBS סטרילי מהחדר הימני עם מזרק סטרילי של 5 מ"ל עם מחט 27 גרם על ידי ניקוב דופן החדר הימני.
   6. לולאה את הרשות הראשית עם משי 4-0 באמצעות מלקחיים של דומונט.
      הערה: ניתן לחבר את ה-PA הראשי ואת אבי העורקים העולה יחד.
   7. פתח חלון של 2 מ"מ מתחת לשסתומי הרשות על ידי חיתוך דופן החדר הימני במספריים קפיציות.
   8. הכנס את קטטר ה-PA דרך החלון ואבטח את המשי 4-0 בלולאה הקודמת (איור 1B).
      הערה: הימנע מלגעת ברשות הפלסטינית במהלך הליך זה, מה שעלול לגרום נזק לקיר הרשות. ניתן לקשור את ה-PA הראשי ואת אבי העורקים העולה ולאבטח אותם יחד.
   9. הזריק 2 מ"ל PBS לאט דרך צנתר PA עם מזרק סטרילי של 5 מ"ל. ודא ששתי הריאות מתרחבות מעט בזמן הזרקת ה-PBS.
   10. קנול קנה הנשימה עם קטטר קנה הנשימה וקשר במקום עם תפר משי 4-0 (איור 1C).
   11. הזרקו 2 מ"ל אוויר לאט דרך צנתר קנה הנשימה עם מזרק סטרילי ריק של 5 מ"ל והחזיקו אותו למשך 10 שניות. ודא שאין דליפת אוויר מהריאות.
   12. הסר את הלב והריאות בגוש. תפוס את קנה הנשימה בעזרת מלקחיים של דומונט ועם קטטר קנה הנשימה בפנים, חתוך את הוושט הצווארי ונתח אותו מהחוליות. חותכים את הוורידים והעורקים התת-בריחיים הדו-צדדיים. לבסוף, חותכים את הוושט ואת הווריד הנבוב בגובה הסרעפת.
       הערה: אל תיגע במשטח הריאה עם מכשירים כלשהם. כל נגיעה קלה עלולה לגרום לדליפת אוויר.
4. דה-סלולריזציה של ריאות העכבר (הליך של 3 ימים)
   הערה: יש לבצע את כל ההליכים בסעיף 1.4 בארון בטיחות ביולוגית נקי.
   1. יום 1
      1. העבירו את גוש הלב-ריאה שנכרת לצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 10 ס"מ ודגרו את גושי הלב-ריאה במי DI סטריליים למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס.
      2. הזריק 2 מ"ל של מים סטריליים דרך צנתר קנה הנשימה 3x ו-2 מ"ל של מים סטריליים דרך קטטר PA עם מזרק סטרילי של 5 מ"ל. עצרו אחרי כל הזרקה כדי לאפשר לנוזל לצאת החוצה בזמן שהריאה נרתעת (איור 1C).
         הערה: הזרקת מים במהירות של כ-0.5 מ"ל לשנייה.
      3. הזרקו 2 מ"ל של תמיסת טריטון X-100 0.1% לצנתר קנה הנשימה ו-2 מ"ל לצנתר PA.
      4. מניחים את גוש הלב-ריאה בצלחת הפטרי ומדגרים באופן סטטי בתמיסת טריטון X-100 למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. יום 2
      1. הסר את תמיסת Triton X-100 מהריאות עם מי DI סטריליים כמתואר בשלב 1.4.1.2.
      2. יש להזריק 2 מ"ל של תמיסת נתרן דאוקסיכולאט 2% לצנתר קנה הנשימה ו-2 מ"ל לצנתר PA. דגירה בתמיסת דאוקסיכולט למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. יום 3
      1. הסר את תמיסת הנתרן דאוקסיכולאט מהריאות עם מי DI סטריליים כמתואר בשלב 1.4.1.2.
      2. הזריק 2 מ"ל של תמיסת NaCl של 1 M לתוך צנתר קנה הנשימה ו-2 מ"ל לתוך צנתר PA. דגירה בתמיסת NaCl למשך שעה אחת ב-RT.
      3. יש להסיר מתמיסת NaCl עם מי DI סטריליים כמתואר בשלב 1.4.1.2.
      4. הזרקת 2 מ"ל של תמיסת עבודה של DNAse I לתוך צנתר קנה הנשימה ו-2 מ"ל לתוך צנתר PA. דגירה בפתרון עבודה DNase למשך שעה אחת ב-RT.
      5. הסר את תמיסת ה-DNase מהריאות כמתואר בשלב 1.4.1.2 אך עם PBS סטרילי. ודא שהריאות לבנות ושקופות בקצה לאחר הליך הדסלולריזציה.
         הערה: ככל שהליך הדסלולריזציה מתקדם, הריאה הופכת שברירית יותר. טפל תמיד בחסימת הלב-ריאה בזהירות והימנע מלגעת במשטח הריאה. לאחר דה-סלולריזציה, ניתן לאחסן את גושי הלב-ריאה ב-PBS/אנטיביוטיקה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.

2. תרבית תאים ראשוניים אנושיים

1. מערבבים את מדיום צמיחת תאי האנדותל -2 (EGM2) וערכת הכדורים המכילה סרום בקר עוברי (ריכוז סופי, 2%), הידרוקורטיזון (ריכוז סופי, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל), גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי (ריכוז סופי, 4 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה אנדותל כלי דם (2 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה דמוי אינסולין R3-1 (ריכוז סופי, 5 ננוגרם/מ"ל), חומצה אסקורבית (ריכוז סופי, 75 מיקרוגרם/מ"ל), גורם גדילה אפידרמיס אנושי (ריכוז סופי, 10 ננוגרם/מ"ל), גנטמיצין/אמפוטריצין-1000 (ריכוז סופי, גנטמיצין: 30 מיקרוגרם/מ"ל, אמפוטריצין: 15 ננוגרם/מ"ל) והפרין (ריכוז סופי, 1 ננוגרם/מ"ל).
2. להפשיר 2 × 10⁶ תאי אנדותל וריד חבל הטבור האנושיים (HUVECs) בבקבוקונים קפואים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. מערבבים את התאים עם EGM2 בצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות.
4. ספור את התאים ותת-תרבית אותם בצפיפות תאים מתאימה (מומלץ 2.0 x 10⁴ תאים/ס"מ² ). התחל מלוחות בפורמט 6 בארות ולאחר מכן העבר לצלוחיות T75.
5. העבירו את התאים עד לקבלת מספר התאים הנדרש.
   הערה: לכיסוי מלא של כלי הדם הריאתיים באמצעות HUVECs, יידרשו 3 × 10⁷ HUVECs¹⁹.

3. הקמת ביו-ריאקטור ותרבית איברי זלוף

1. הכנת תא איברים ומאגר תאים
   1. חותכים חורים בפקק סיליקון באמצעות מקדח שעם, כפי שמוצג באיור 2A. גדלי החורים הם 5 מ"מ (i, ii ו-iii), ו-7 מ"מ (iv ו-v). כל מספר חור (i-v) באיור 2A מתאים למספרי החורים באיור 2B.
   2. הכנס את צינור המשאבה דרך פקק הסיליקון כפי שמצוין באיור 2B.
   3. חותכים חור של 5 מ"מ במחיצת סיליקון של מכסה בורג פתוח בעזרת מקדח שעם. הכנס צינור L/S 14 מרפא פלטינה לתוך החור (איור 2B,C).
   4. חיטוי החומרים שלמעלה, כולל פקק הסיליקון עם צינורות, מיכל הזכוכית, מכסה הבורג GL-45 עם צינורות, בקבוק זכוכית הניתן לחיטוי בנפח 250 מ"ל וצינור L/S 14 עם אביזרי פיתוי (צינורות B וצינורות C באיור 3A) למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס. בחר אביזרי פיתוי מתאימים כדי להבטיח שצינורות B ו-C יוצרים לולאה.
      הערה: מיכל הזכוכית משמש לתא עוגב, ובקבוק הזכוכית של 250 מ"ל משמש למאגר תאים.
2. הרכבת מעגל ביו-ריאקטור מבוסס זלוף
   הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים על ספסל נקי.
   1. הוסף 70 מ"ל של אמצעי תרבית למיכל הזכוכית ולאחר מכן, הנח את פקק הסיליקון על גבי מיכל הזכוכית.
   2. הרכיבו פקק סיליקון, מיכל זכוכית, מכסה בורג GL-45 עם צינורות, בקבוק זכוכית הניתן לחיטוי בנפח 250 מ"ל וצינור L/S 14 עם אביזרי פיתוי באמצעות פקקי עצירה תלת-כיווניים כמתואר באיור 3A. הכנס מחט 20 גרם למחיצת סיליקון של מכסה בורג GL-45.
   3. מלאו את המדיה בצינורות A, B ו-C במזרק של 10 מ"ל המחובר לפקקי עצירה i) ו-iii) (יהיה צורך ב~3-5 מ"ל של מדיה כדי למלא 1 מ' של צינור). חזור על הזרקת המדיה ומשיכת המדיה באמצעות מזרק של 10 מ"ל דרך תא עצירה תלת כיווני כדי להבטיח שאין בועת אוויר בתוך הצינור.
   4. חבר את קטטר ה-PA של בלוק הלב-ריאה המנותק באמצעות אביזר פיתוי המחובר לצינור C. הימנע מבועות אוויר בצנתר או בצינור.
   5. קציר והשעיה מחדש של HUVECs בצפיפות של 0.5-1 × 10⁶ תאים/מ"ל ב-EGM2. הוסף את תרחיף התאים משלב 2.5 למאגר התא.
      הערה: רצוי להכין את תרחיף התאים בין שלבים 3.2.4 ו-3.2.5. הכניסו מוט ערבוב למאגר התא.
3. הזרקה מונעת כוח הכבידה של תאי אנדותל
   1. הנח את מאגר התא המכיל HUVECs על מערבל מגנטי. ודאו שתחתית מאגר התא נמצאת 30 ס"מ מעל תא האיברים (איור 2D ואיור 3A).
   2. הפעל את המערבל המגנטי במהירות של כ-120 סל"ד.
   3. פתח את תא העצירה i) ו-ii) כך שניתן יהיה להזריק את תרחיף התא לפיגום הנטול תאים באמצעות צינורות A, צינורות C וצנתר PA.
      הערה: בעת הזרקת 3 × 10⁷ תאים בצפיפות תאים של 1 × 10⁶ תאים/מ"ל, נפח תרחיף התא צריך להיות 30 מ"ל. קצב הזרקה טיפוסי הוא 1-2 מ"ל לדקה.
   4. לאחר הזרקה מלאה של מתלה התא, נתק את צינור A מ-Stopcock ii).
      הערה: ניתן לבצע ספירת תאים בשלב זה כדי למדוד את קצב שימור התאים בפיגום הנטול תאים. שיעור שימור התאים האופייני הוא 80-90%, ללא קשר למספר התאים המוזרקים¹⁹.
      איכות פיגום הריאה המפורק קובעת בקפדנות את קצב שימור התאים. כל דליפה מהריאה הנטולת תאים (למשל, מה-PA הראשי, משטח הריאה) גורמת לשיעור שימור תאים נמוך יותר. ודא כי אין דליפה נראית לעין מהריאה הנטולת תאים על ידי הזרקת 2-3 מ"ל של מצע תרבית עם מזרק סטרילי המחובר לאחד מפקקי העצירה בביו-ריאקטור מבוסס זלוף ואשר שהריאות המפורקות מתרחבות מעט עם הזרקת המדיה.
4. תרבית איברים זלוף
   1. הנח את תא האיברים בחממת CO₂ .
   2. תקן את צינור B לראש משאבה המחובר למשאבה פועמת.
   3. סגור את דלת הזכוכית של חממת CO₂ . ודא שהצינור ממוקם כראוי בין דלת הזכוכית לאטם הגומי (איור 3B).
   4. דגרו את הפיגום הנטול תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות כדי לאפשר לתאי האנדותל המוזרקים להתיישב בפיגום.
      הערה: ודא שהמשאבה הפועמת תמיד כבויה בין שלבים 3.4.1 ו-3.4.4.
   5. הפעל את המשאבה בקצב של 6 סל"ד, מה שמביא לזלוף מדיה של 2 מ"ל/דקה באמצעות צינור L/S 14. צפו בריאה נטולת תאים מתרחבת מעט עם זלוף המדיה.
   6. סגור את דלת החממה (איור 3C).
   7. בצע את שינוי המדיה באמצעות Stopcock iii). החלף מחצית מהמדיה כל יומיים או שלושה.
      1. עצור את כונן המשאבה, חבר מזרק סטרילי של 50 מ"ל לתא העצירה iii), והוצא 50 מ"ל מדיה מהתא.
      2. מלאו מזרק סטרילי נוסף של 50 מ"ל ב-50 מ"ל של מדיה מחוממת מראש והעבירו את המדיה לתא דרך תא עצירה III). החלף את תא העצירה כראוי ולאחר מכן הפעל את המשאבה הפועמת.
   8. קצור את גוש הלב-ריאה המחודש לאחר יומיים לפחות של תרבית איברי זלוף.
      הערה: במחקר שלנו, יומיים של תרבית זלוף הספיקו כדי לבצע רה-וסקולריזציה הומוגנית של פיגום הריאה הנטול תאים באמצעות 3 × 10⁷ HUVECs. כאשר משתמשים בפחות מ-3 ×-^10-7 HUVECs, ייתכן שתידרש דגירה ארוכה יותר כדי לשפר את יעילות התאים.

4. השתלה אורתוטופית של הריאה המהונדסת ביולוגית

1. הכנת תרופות
   1. הכינו חומר הרדמה משולב MMB על ידי ערבוב מידזולם (ריכוז סופי, 4 מ"ג/ק"ג), מדטומידין (ריכוז סופי, 0.75 מ"ג/ק"ג) ובוטואורפנול טרטרט (ריכוז סופי, 5 מ"ג/ק"ג) עם תמיסת מלח תקינה בדרגה קלינית.
   2. הכן תמיסת הפרין על ידי ערבובה עם תמיסת מלח רגילה בדרגה קלינית (ריכוז סופי, 1000 U/mL).
   3. הכן נתרן צפזולין על ידי ערבוב שלו עם תמיסת מלח רגילה בדרגה קלינית (מנה אחת, 30 מ"ג/ק"ג).
2. הליך כירורגי
   1. הכנת אזיקים
      1. שפשפו קלות את שלושת סוגי האנגיוקטטר בנייר זכוכית עדין כדי להקל על הכלים להישאר אזוקים.
      2. הכן שרוול סימפונות מאנגיוקטטר טפלון 20 גרם באורך 1 מ"מ באמצעות אזמל #11. לפני חיתוך האנגיוקטטר, השתמש בחלק האחורי של אזמל #11 כדי ליצור שקע באנגיוקטטר כדי לקשור את הניילון 10-0.
      3. הכן את שרוול וריד הריאה (PV) מאנגיוקטטר טפלון 22 גרם באורך 0.8 מ"מ ואת שרוול ה- PA מאנגיוקטטר טפלון 24 גרם באורך 0.6 מ"מ.
         הערה: ניתן לבצע הכנה זו לפני יום הניסוי.
   2. הצמדת השרוול לריאה המהונדסת ביולוגית
      1. הניחו את גוש הלב-ריאה על פיסת גזה סטרילית לחה במי מלח קרים, הניחו תחתיו חתיכה נוספת של גזה יבשה ונקייה והניחו צלחת פטרי בקופסת קלקר מלאה בקרח נקי.
         הערה: הנחת הגזה היבשה מונעת מגוש הלב-ריאה לקפוא בטעות.
      2. הניחו קליפס מפרצת כדי לאבטח את קנה הנשימה ואת הגזה (איור 4A). הניחו חתיכת גזה קטנה על הלב, המכסה גם את הריאה הימנית. הניחו גזה נוספת על הריאה השמאלית. התאם את הנסיגה הזו עם הגזה הלחה כדי לחשוף את ההילום השמאלי בצורה ברורה ככל האפשר.
      3. נתחו בזהירות את המבנים ההילריים זה מזה באמצעות מיקרו מלקחיים ישרים או זוויתיים, בהתאם להעדפה (איור 4B). התחל לנתח מהרצועה הריאה לאורך עצב הנרתיק. חתכו את הצדר הקרביים מתחת ל-PV, והעבירו את אבי העורקים היורד ועצב הנרתיק יחד דרך החלק האחורי של הילום הריאתי השמאלי לצד הגולגולת.
      4. נתחו את ה-PA הראשי השמאלי מגזע הריאה ועד לקצה הריאה השמאלית (איור 4C). לאחר מכן, חלקו את הרשות הפלסטינית בגובה תא המטען הריאתי כדי לקבל אורך מתאים.
      5. נתחו את ה-PV השמאלי מהצד השמאלי של האטריום השמאלי עד לקצה הריאה השמאלית (איור 4D). חלקו את ה-PV השמאלי בגובה האטריום השמאלי כדי לקבל אורך מתאים.
      6. תלו את שרוול ה-PA ממש מעל ה-PA באמצעות הייצוב clamp והכנס את ה-PA לתוך השרוול (איור 4E). קפלו את ה-PA מעל השרוול), וחשפו את משטח האנדותל. אבטח סביב השרוול עם עניבת ניילון 10-0 (איור 4F). הנח את השרוול על ה-PV בצורה זהה (איור 4G,H).
      7. מחלקים את הסימפונות השמאליים בגובה הקרינה. הניחו את השרוול על הסימפונות בצורה זהה (איור 4I).
   3. נוהל עבור העכבר הנמען
      1. להרדים את העכבר המקבל בתערובת של MMB i.p. עם מחט 27 G ואינטובציה על ידי החדרת אנגיוקטטר פוליאוריטן 20 G מתחת למיקרוסקופ. הנח את העכבר הנמען על מחמם חשמלי מתכוונן לטמפרטורה במצב דקוביטוס רוחבי ימני וחבר את האנגיוכאטטר למכונת הנשמה. הגדר את הגדרת מכונת ההנשמה באופן הבא: חמצן 2 ליטר לדקה, קצב נשימה 120 פעימות לדקה, נפח גאות ושפל 0.5 מ"ל. עקר את דופן בית החזה עם 70% אתנול והזריק את תערובת הצפזולין s.c.
      2. חותכים את העור במספריים. חותכים את הרקמה והשרירים התת עוריים בעזרת צריבה. פתח את החזה דרך החלל הבין-צלעי^השלישי והנח את מחזירי החזה.
         הערה: למרות שבית החזה צריך להיות גדול מספיק להשתלה, אל תפגע בעורק החלב הפנימי, מה שעלול להוביל לדימום מסיבי.
      3. נתח את הרצועה הריאתית בעזרת צמר גפן ומספריים קפיציים גדולים. הנח חומר ניקוי עורקים מעוקל על הריאה השמאלית של הנמען כדי להחזיר את הריאה בקלות. בעזרת מיקרו-מלקחיים זוויתיים, נתחו את הצדר המדיאסטינלי סביב הילום הריאתי השמאלי.
         הערה: הבסיס לניתוח הצדר דומה לכריתת ריאות אנטומית של אדם.
      4. נתחו את ה-PA מהסמפונות באמצעות מיקרו-מלקחיים מעוקלים מהמדיאסטינום עד לקצה הריאה השמאלית (איור 5A). נתח את הסימפונות מ- PV בצורה דומה.
         הערה: ניתן לבצע דיסקציה בקלות כאשר הצדר מנותח בתמרון הקודם (שלב 4.2.3.3).
      5. הניחו קשר של משי 10-0 בבסיס ה-PA כדי לחסום (איור 5B). הניחו קליפ מפרצת בזווית דקה בבסיס ה-PV והסימפונות (איור 5C).
      6. לולאה 10-0 ניילון סביב הסימפונות, הרשות הפלסטינית ו-PV, והשאיר רופף כדי לאבטח את האזיקים בשלבים הבאים.
      7. חתכו את ה-PA, הסימפונות וה-PV של הנמען בקצה הריאה השמאלית של הנמען באמצעות מספריים מיקרו-קפיציים (איור 5D). הרחב בעדינות את ה-PA וה-PV באמצעות מיקרו מלקחיים ישרים. הסר את הדם ב-PA וב-PV עם מי מלח באמצעות מזרק של 1 מ"ל ואנגיוקתטר של 24 גרם.
         הערה: החתכים של PA, הסימפונות וה-PV הם כשליש מהדרך. מלקחיים המיקרו הישרים עדינים ומתאימים להרחבה.
      8. הניחו את הריאה המהונדסת ביולוגית, המכוסה בגזה לחה, על גבי הריאה השמאלית של הנמען (איור 5E), קרוב ככל האפשר למדיאסטינום של הנמען.
      9. הכנסת שרוול ה-PA של התורם לתוך ה-PA של הנמען (איור 5F).
         הערה: תהיה מתיחה מסוימת על הרשות הפלסטינית התורמת. אם גודל החתך של הרשות הפלסטינית מתאים, יש פחות סיכוי שהשרוול של התורם ייעקר. הזזת הריאה המהונדסת ביולוגית קרוב למדיאסטינום תמנע גם את עקירת השרוול של התורם.
      10. אבטח סביב השרוול עם עניבת ניילון 10-0 (איור 5G). באופן דומה, הכנס ואבטח את הסימפונות התורמים (איור 5H) ואת אזיקי ה-PV (איור 5I,J).
      11. הסר את קליפ המפרצת בעל הזווית הדקה (איור 5L). שימו לב שהדם זורם לאחור מעבר לשרוול ה-PV והסירו את עניבת המשי על PA כדי לחדש את זרימת הדם הקדמית לריאה המהונדסת ביולוגית.

בעקבות פרוטוקול הדה-סלולריזציה, ריאות העכבר הן לבנות ושקופות באופן ניכר (איור 6A). יש להסיר לחלוטין רכיבים תאיים, אך המבנה המכתשית נשאר שלם בתצפית ההיסטולוגית (איור 6B,C). ריאות עכבר שעברו תאים באמצעות 3 × 10⁷ HUVECs עם תרבית ביו-ריא?...

ביו-הנדסת איברים היא מפעל תובעני. תהליך הסינון היקר מעכב את מחזור המחקר והפיתוח של תחום זה. על ידי שימוש בעכברים כפלטפורמה ניסיונית, החלל, התאים והמדיה מצטמצמים משמעותית בהשוואה לפלטפורמת החולדות ששימשה בעבר. למרות שעדיין לא הושגה מדידת פרמטרים פיזיקליים מפורטים כגון ח?...

למחברים אין ניגודי אינטרסים לגבי כתב היד הזה.

מחקר זה נתמך כספית על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, הקרן לקידום מחקר בינלאומי משותף (טיפוח מחקר בינלאומי משותף (B)) #22KK0132 עבור TS, JSPS KAKENHI מענק מספר 21K08877 עבור TW, מענק Leave a Nest פרס Ikeda-Rika עבור FT, ומענק סיוע לעמיתי JSPS #21J21515 עבור FT. אנו מעריכים מאוד את גב' מאיקו אואדה, הצוות הטכני בליבת המחקר הביו-רפואי של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת טוהוקו, על עבודתה האינטנסיבית בתצפית היסטולוגית. אנו מעריכים גם את הייעוץ הטכני של גב' יומי יושידה ומר קוג'י קאג'י במרכז למכשירי מחקר ב-IDAC, אוניברסיטת טוהוקו, על תמיכתם בעיבוד תמונה.