נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

קו תאי THP-1 של לוקמיה מונוציטית חריפה אנושית (AML) נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקר הפונקציות של מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים, כולל יחסי הגומלין שלהם עם פתוגנים אנושיים משמעותיים כגון נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). בהשוואה לקווי תאים אימורטליים אחרים ממקור מיאלואידי, תאי THP-1 שומרים על מסלולי איתות דלקתיים שלמים רבים ומציגים מאפיינים פנוטיפיים הדומים יותר לאלה של מונוציטים ראשוניים, כולל היכולת להתמיין למקרופאגים כאשר הם מטופלים בפורבול-12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA). השימוש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9 להנדסת תאי THP-1 באמצעות נוקאאוט גן ממוקד (KO) מספק גישה רבת עוצמה לאפיון טוב יותר של מנגנונים הקשורים למערכת החיסון, כולל אינטראקציות בין וירוס למארח. מאמר זה מתאר פרוטוקול להנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 המשתמשת באלקטרופורציה כדי להעביר ריבונוקלאופרוטאינים Cas9:sgRNA שהורכבו מראש לגרעין התא. שימוש במספר sgRNAs המכוונים לאותו לוקוס במיקומים מעט שונים מביא למחיקה של שברי DNA גדולים, ובכך מגביר את יעילות העריכה, כפי שהוערך על ידי בדיקת T7 endonuclease I. עריכה בתיווך CRISPR-Cas9 ברמה הגנטית אומתה על ידי ריצוף סנגר ואחריו ניתוח הסקה של עריכות CRISPR (ICE). דלדול החלבון אושר על ידי אימונובלוטינג יחד עם בדיקה פונקציונלית. באמצעות פרוטוקול זה הושגו עד 100% אינדל בלוקוס הממוקד וירידה של למעלה מ-95% בביטוי החלבון. יעילות העריכה הגבוהה מקלה על בידוד שיבוטים של תא בודד על ידי הגבלת הדילול.

THP-1 הוא קו תאים אנושי שמקורו במונוציטים שבודד מחולה הסובל מלוקמיה חריפה (AML), המציג מאפיינים פנוטיפיים הדומים מאוד לאלה של מונוציטים ראשוניים¹. בהשוואה למקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים, שאינם מתחלקים ומציגים הן תוחלת חיים מוגבלת והן שונות בין/תוך-תורם בפנוטיפ, ניתן לתרבת תאי THP-1 כמעט לנצח ויש להם התנהגות הומוגנית יותר המעדיפה שחזור תוצאות 2,3,4,5,6 . יש לציין כי ניתן להתמיין בתאי THP-1 לכיוון פנוטיפ דמוי מקרופאגים עם phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA), מה שהופך אותם למודל מבחנה בשימוש נרחב לחקירת התגובות של מונוציטים/מקרופאגים לאותות דלקתיים 7,8,9,10,11,12,13 או זיהום על ידי פתוגנים אנושיים רלוונטיים מבחינה קלינית, כולל HIV ^14,15,16. האפשרות להנדס גנטית תאי THP-1 מעניינת בתחומי מחקר רבים הקשורים לביולוגיה.

Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9 (CRISPR-Cas9) הוא מערכת חיסון אדפטיבית פרוקריוטית המבוססת על נוקלאז מונחה RNA כדי לפרק גנומים נגיפיים פולשים, אשר תוכנתה מחדש ככלי להנדסה גנטית¹⁷. תהליך עריכת הגנום מתנהל בשלושה שלבים: זיהוי, מחשוף ותיקון. RNA מדריך יחיד (sgRNA) מגייס את נוקלאז Cas9 למיקום גנומי ספציפי באמצעות זיווג בסיסים עם רצף המדריך של 20 bp. נוכחותו של רצף Protospacer Adjacent Motif (PAM) ישירות 3' מרצף המטרה הגנומי של 20 bp מפעילה את ההתפרקות והפיצול בתיווך Cas9 בשני גדילי ה-DNA בין מיקומים 17 ו-18 (3-bp 5' של ה-PAM). שבירת הגדיל הכפול (DSB) המתקבלת מעובדת על ידי שני מסלולי תיקון עיקריים. בהיעדר תבנית תיקון הנושאת הומולוגיה עם הלוקוס הפגום, מסלול הצטרפות הקצה הלא-הומולוגי (NHEJ) הנוטה לשגיאות יציג הכנסות ו/או מחיקות אקראיות של נוקלאוטידים (indels), מה שעלול להוביל למוטציות בשינוי מסגרת ו/או הכנסת קודוני סיום מוקדמים (PTC). בתורו, mRNAs המכילים PTC ממוקדים על ידי פירוק על ידי מסלול דעיכת mRNA בתיווך שטויות (NMD), ובסופו של דבר משבשים את ביטוי/תפקוד החלבון 18,19,20. לחלופין, מסלול התיקון המונחה הומולוגיה (HDR) התלוי בתבנית יכול לפעול ולתקן נאמנה את ה-DSB. מנגנון זה נרתם להשגת עריכה גנטית מדויקת, כולל דפיקות והחלפות בסיסים. ראוי לציין כי מצב מחזור התא הוא גורם חשוב המשפיע על בחירת מסלול תיקון DSB. ואכן, NHEJ פעיל בכל שלבי מחזור התא, בעוד ש-HDR מוגבל בעיקר לשלבי S/G2²¹.

תאי THP-1 גדלים בתרחיף וידועים לשמצה כקשים להעברה עם DNA פלסמיד, הליך שאולי גם משנה את הכדאיות ו/או יכולת ההתמיינות שלהם^22,23. התמרה עם וקטורים לנטי-ויראליים מבוססי HIV-1 המקודדים הן את Cas9 והן את ה-sgRNA משמשת לעתים קרובות כדי להפיל (KO) גן מעניין²⁴. שילוב קלטת Cas9/sgRNA בגנום התא מבטיח ביטוי ממושך ו-KO יעיל, אך הוא גם מקור מתמשך להשפעות מחוץ למטרה²⁵. לחלופין, הריבונוקלאופרוטאינים Cas9:sgRNA (RNPs) שהורכבו מראש מועברים על ידי אלקטרופורציה, שיטה הכוללת היווצרות זמנית של נקבוביות הן בפלזמה והן בממברנות הגרעין בעת הפעלת דחפים חשמליים. שימור כדאיות התאים הוא אתגר חשוב בעת נקיטת גישה זו.

כאן, קו תאים THP-1 המבטא ביציבות GFP (THP-1_GFP) הופק כדי לשמש ככלי להקמת פרוטוקול להשגת עריכה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9. לאחר תכנון אסטרטגיה להשבתת הגן EGFP באמצעות שלושה sgRNAs בו זמנית (גישה מרובת מדריכים), נקבעה יעילות KO בין מספר תנאי אלקטרופורציה באמצעות ביטוי GFP כקריאה. התפשטות התאים נוטרה במקביל. עריכת גנים אושרה הן על ידי בדיקת T7 endonuclease I (T7EI) והן על ידי ריצוף Sanger, ואחריו ניתוח עם אלגוריתם Inference of CRISPR Edits (ICE)²⁶. פרמטרים שהניבו ירידה של עד 95% בביטוי GFP, כאשר תאי THP-1 התאוששו משיעורי גדילה תקינים לאחר אלקטרופורציה, הופעלו בהצלחה כדי לנטרל גן אנדוגני (SAMHD1) ולייצר שיבוטי THP-1 חד-תאיים.

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. עיצוב מדריך עם CRISPOR (איור 1.1)

הערה: ניתן להשתמש בתוכנת SnapGene Viewer בשלבים 4, 7 ו-10 כדי להוסיף הערות לאתר יעד העריכה ולמיקום הכלאת פריימר ה-PCR בתוך הגן המבוקש.

1. היכנסו לאתר האנסמבל (www.ensembl.org). בתיבה חיפוש , בחר מין והזן את שם הגן המעניין. לחץ על Go. בחר את התוצאה המתאימה לגן (לא לתעתיק).
2. לחץ על הצג טבלת תמלול ולאחר מכן בחר את מזהה התמלול המתאים לקידוד החלבון עם תווית הזהב בעמודה ביוטייפ . לאחר דף התמליל, לחץ על Exons בתפריט השמאלי.
3. גלול מטה ולחץ על הורד רצף. ודא שפורמט הקובץ הוא FASTA. בהגדרות - רצפים כלולים, בטל את הבחירה בכל הפריטים מלבד רצף גנומי.
   הזן את המספר "500" ברצף האגפים בכל אחד מקצוות תיבת התמלול . לחץ על תצוגה מקדימה, בחר את כל הרצף (רק את הנוקלאוטידים ללא הכותרת), והעתק אותו (Ctrl+C).
4. פתח את SnapGene Viewer ולחץ על קובץ DNA > חדש. הדבק את הרצף (Ctrl+V) בתיבה צור רצף . בטל את הסימון של זהה תכונות נפוצות ובחר ליניארי בטופולוגיה.
   שנה את שם הקובץ ולחץ על צור. בתפריט השמאלי, בטל את הבחירה באפשרות הצג אנזימים (סמל ראשון). בחלק התחתון של החלון, בחר את הכרטיסיה רצף .
   הערה: שלב זה מאפשר אחזור של רצף הגנים השלם, כולל אקסונים, אינטרונים ורצפי אגף של 500 bp (אופציונלי). מידע אחרון זה שימושי לתכנון פריימרים PCR להגברה של אתר יעד הממוקם בתוך האקסון הראשון.
5. בחזרה לאתר Ensembl, גלול למעלה בתצוגה המקדימה של הקובץ ולחץ על הקודם. כעת, שנה את פורמט הקובץ ל-RTF. בהגדרות - רצפים כלולים, בטל את הבחירה בכל הפריטים מלבד Exons. בהצג משתנים, בחר לא. לחץ על הורד בראש העמוד.
6. פתח את הקובץ שהורדת (עם Word), המכיל את רצף האקסונים ומציג את רצף הקידוד בכחול, החל מה-ATG הראשוני. בחר את האקסון שימוקד על ידי העריכה המכוונת CRISPR-Cas9 (ראה להלן להמלצות), בחר אותו והעתק אותו (Ctrl+C).
   1. האקסון הממוקד הוא אקסון מוקדם או אקסון המקודד תחום חשוב מבחינה תפקודית של החלבון. ראוי לציין כי הקמת PTC באקסון מאוחר קרוב ל-3' UTR ככל הנראה לא תצליח לעורר NMD, מה שיוביל לביטוי של חלבון קטום C-terminally. לעומת זאת, הכנסת PTC באקסון מוקדם קרוב לאתר ההתחלה המקורי קשורה לסיכון של תרגום לא לגיטימי (ITL, הידוע גם בשם התחלת תרגום חלופי (ATI)), המניב ביטוי בלתי צפוי של חלבון קטום N-terminally שמתחיל באתרי התחלת תרגום בתוך המסגרת (TIS) במורד הזרם של קודון ה-ATG הראשון. כדי להפחית את הסיכון האחרון, מומלץ להעריך את התרחשותם של TIS חלופיים באמצעות ATGpr²⁷ (atgpr.dbcls.jp) ו/או NetStart 1.0²⁸ (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
   2. ודא שאקסון היעד מכיל רצף קידוד. עם זאת, זה עשוי להיות שימושי לבחור חישול sgRNA עם אזור 5'UTR במעלה הזרם של ה-ATG הראשוני כדי לכלול אותו בקטע שנמחק.
   3. באופן אידיאלי, האקסון הממוקד צריך להיות משותף לכל גרסאות התעתיק המקודדות לחלבון של הגן. בדוק אם זה המקרה במציג נתוני הגנום של NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) על ידי חיפוש הגן המעניין.
      לחיצה על שם הגן (בירוק) בחלון התצוגה תציג את גרסאות התעתיק (בסגול). אקסונים מיוצגים על ידי מלבן.
7. ב- SnapGene Viewer, הקש Ctrl+F, Ctrl+V ולאחר מכן Enter כדי לחפש את רצף האקסון. לחץ על Ctrl+T כדי להוסיף תכונה חדשה, תן לה שם, שנה את הסוג ל"אקסון" ולחץ על אישור.
8. עבור לאתר CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) והדבק את רצף האקסון בשלב 1. ראשית, בחר גנום ייחוס בשלב 2 ולאחר מכן את סוג ה-PAM שיש למקד בשלב 3, בדרך כלל 20bp-NGG עבור SpCas9. לחץ על שלח.
9. בחר שני sgRNA כך שהם יופרדו עד 150 bp, ולאחר מכן בחר sgRNA שלישי ביניהם. להלן מספר הנחיות לבחירת sgRNA:
   1. ציון הספציפיות של MIT קשור להשפעות מחוץ למטרה. ציון גבוה יותר מצביע על פחות שחקנים פוטנציאליים מחוץ למטרה. העמודה הימנית מציגה שלושה אתרים חזויים מחוץ למטרה המדורגים מהסבירות הגבוהה ביותר לסבירות הנמוכה ביותר, יחד עם מיקומם (באקסון, אינטרון או אזור בין-גני). ניתן לגשת לרשימה המלאה של אתרים צפויים מחוץ ליעד על ידי לחיצה על הצג הכל. במידת האפשר, בחר sgRNAs עם ציון MIT >80, ותעדוף את אלה ללא מטרות עבור 0, 1 או 2 אי התאמות. בנוסף, יש להימנע מ-sgRNAs עם מטרות מחוץ לאקסון, שיש להם את הפוטנציאל הגדול ביותר להשפיע על הפנוטיפ.
   2. ליעילות חזויה, עיין בציון Doench '16. שימו לב שציון גבוה של Doench '16 פשוט מצביע על כך שה-sgRNA סביר יותר להיות יעיל. יש לקבוע את היעילות בפועל בניסוי. מסיבה זו, תמיד כדאי לבחור מספר sgRNAs, גם אם הם אינם מיועדים לשימוש יחד.
   3. תכולת GC גבוהה מדי או נמוכה מדי, כמו גם מוטיבים מסוימים, עלולים להזיק ליעילות sgRNA ויש להימנע מהם. פרמטרים אלה מודגשים על ידי CRISPOR.
10. חזור על שלב 1.7 כדי להוסיף את רצף ה-sgRNA ואת רצף ה-PAM המשויך לרצף הגנים ב-SnapGene Viewer. במקביל, הדבק את רצף ה-sgRNA (ללא ה-PAM) בקובץ טקסט או Excel כדי לשמור על הכיוון 5'-3' הנדרש בעת הזמנת האוליגונוקלאוטיד.
11. להגברה מבוססת PCR של אתר היעד, תכנן כמה פריימרים המקיפים אותו. גודל האמפליקון צריך להיות בין 800 ל-1000 bp. PrimerQuest שימש לעיצוב הפריימרים לפרוטוקול זה (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). לחלופין, CRISPOR מספק רשימה של פריימרים כדי להגביר את האזור הגנומי הממוקד כמו גם את האתרים מחוץ למטרה. לאחר הצגת הרשימה המלאה של אתרים פוטנציאליים מחוץ ליעד (שלב 1.9.1), לחץ על פריימרים מחוץ למטרה בפינה השמאלית התחתונה.

2. ריאגנטים והכנת תאים לאלקטרופורציה (איור 1.2)

1. הכן צלחת תרבית של 24 בארות לשחזור תאים לאחר אלקטרופורציה על ידי מילוי הבארות ב-500 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640 בתוספת 20% מומת בחום (56 מעלות צלזיוס, 30 דקות), מסונן (0.20 מיקרומטר) סרום בקר עוברי (FBS). אין להוסיף אנטיביוטיקה. שמור את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות עד לאלקטרופורציה.
2. אם ה-sgRNAs נשלחים יבשים, יש להחזיר אותם ללחות עם מאגר TE (10 מ"מ Tris, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) לריכוז סופי של 100 מיקרומטר (כלומר 10 מיקרוליטר של מאגר TE לכל 1 ננומול של sgRNA). מערבולת למשך 30 שניות, דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר התייבשות מלאה, ולאחר הומוגניזציה קצרה של פיפטה, אחסן את תמיסת מלאי ה-sgRNA ב-20 מעלות צלזיוס. בהתאם לנפח הסופי, בצע ציטוטים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה מרובים.
3. הכן תמיסת sgRNA עובדת בריכוז סופי של 30 מיקרומטר על ידי דילול תמיסת המלאי של 100 מיקרומטר במים נטולי נוקלאז. מערבולת למשך 30 שניות ודגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הרכיבו את ה-Cas9:sgRNA RNPs ביחס מולארי של 1:9 על ידי דילול בו-זמני של 1 μL של כל אחד משלושת ה-30 μM sgRNAs ו-0.5 μL של תמיסות Cas9 של 20 μM ב-3.5 μL של מאגר השעיה מחדש R, הכלול בערכת האלקטרופורציה (נפח סופי של 7 μL, עבור תנאי ניסוי אחד; קנה מידה בהתאם). מערבולת קצרה ודוגרת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. בינתיים, הכינו בקרה לא ערוכה על ידי הוספת 0.5 מיקרוליטר של 20 מיקרומטר Cas9 ל-6.5 מיקרוליטר של מאגר השעיה מחדש R. מערבולת לזמן קצר ודגרו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הוסף 5 מיקרוליטר של מאגר השעיה R לכל הדגימות לנפח סופי של 12 מיקרוליטר לכל מצב אלקטרופורציה.
7. הכן את תאי THP-1 לאלקטרופורציה.
   1. להעריך ריכוז וכדאיות על ידי מבחן אי הכללה כחול טריפאן. יש לדלל את התאים ביחס של 1:2 בתמיסת צביעה כחולה של 0.4%. לאחר דגירה של 30 שניות, הומוגניזציה היטב והוסף 10 מיקרוליטר בקיר של תא ספירה עם סגנון רשת משופר של נויבאואר. ספרו שלושה ריבועים גדולים וחלקו את הספירה ב-100 כדי לקבל את ריכוז התא (x10⁶ תאים/מ"ל).
      הערה: בריאות התאים משפיעה על רגישותם לאלקטרופורציה. יש להקפיד לבצע את תרבית התאים בתנאים אופטימליים. יש להגביל את הזמן מחוץ לחממה, ולהכין ולחמם את כל הריאגנטים והפתרונות מראש.
   2. עבור כל תנאי, אסוף נפח שווה ערך ל-0.2 x 10⁶ תאים וצנטריפוגה (336 x גרם, 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס).
   3. שאפו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS. שוב צנטריפוגה (336 x גרם, 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס).
   4. שאפו את הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה והשעו מחדש את כדורית התא THP-1 עם 12 מיקרוליטר של תמיסת RNP (שלב 2.6).

3. הקמת מערכת אלקטרופורציה ונוקלאופקציה (איור 1.3)

1. הנח את תחנת הפיפטה מתחת לארון בטיחות ביולוגית, הכניס צינור אלקטרופורציה לתמיכה, והוסף 3 מ"ל של מאגר E, הכלול בערכת האלקטרופורציה.
2. לאחר הפעלת מכשיר האלקטרופורציה, השתמש במסך המגע כדי להגדיר את פרמטרי האלקטרופורציה הבאים: מתח = 1 500 וולט, משך = 10 אלפיות השנייה, מספר = 3.
3. ציידו את פיפטת האלקטרופורציה בקצה ושאבו 10 מיקרוליטר מתמיסת RNP/THP-1 (שלב 2.7.4). הכנס את הפיפטה לתוך צינור האלקטרופורציה ולחץ על התחל במסך מכשיר האלקטרופורציה. המתן להופעת ההודעה הושלם והסר את הפיפטה מהצינור.
4. העבירו את התאים לבאר של צלחת 24 הבארות שחוממה מראש והומוגניזציה בעדינות. החזירו את הצלחת לאינקובטור הלח ותנו להם לנוח ללא הפרעה במשך 72 שעות.
   הערה: הקפד לא ליצור בועות בעת פיפטינג של מתלה RNP/THP-1, מכיוון שהן יפריעו להליך האלקטרופורציה. אם מופיעה הודעת שגיאה בהיעדר קשת חשמלית גלויה, הסר את פיפטת האלקטרופורציה מהצינור ולחץ שוב על התחל . עם זאת, אם נצפתה קשת חשמלית בצורת ניצוץ בהיר קצר, זה עשוי להצביע על נוכחות של בועות. הליך האלקטרופורציה צפוי להיכשל, גם בהיעדר הודעת שגיאה.

4. התאוששות THP-1 72 שעות לאחר אלקטרופורציה (איור 1.4)

1. ספרו את התאים כדי להעריך את הריכוז (שלב 2.7.1) 72 שעות לאחר האלקטרופורציה.
2. אם יש מספיק תאים (כלומר, ≥0.6 x 10⁶ תאים/מ"ל), יש לדלל אותם לפחות פקטור 2 עם RPMI בתוספת 20% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ולהביא את הריכוז בין 0.3-0.5 x 10⁶ תאים למ"ל. אחרת, אפשר לתא להתאושש למשך 72 שעות נוספות.
3. מעבר והגברה של התאים עד שיהיה מספיק לאימות KO. בינתיים, ניתן להתחיל בבידוד של שיבוטים חד-תאיים (שלב 7).

5. אימות עריכת גנים על ידי בדיקת אי התאמה T7EI (איור 1.5)

הערה: הבדיקה עלולה להמעיט ביעילות העריכה בהתחשב בכך ש-T7EI מזהה אי-התאמות גדולות מ-1 bp. לפיכך, בדיקת T7EI אינה שימושית לסינון אוכלוסיות תאים הומוזיגוטיות (כלומר, שיבוטים של תא בודד) אלא אם כן היא שונה כראוי (שלב 5.7).

1. העריכו את ריכוז התאים (שלב 2.7.1) ומשכו נפח שווה ערך ל-0.1 x 10⁶ תאים בצינור של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה (336 x גרם, 5 דקות, 20 מעלות צלזיוס), שואבים את הסופרנטנט ומשהים מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS. שוב צנטריפוגה ובעזרת פיפטה, שאפו כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. הקפיאו את הדגימה בהצמדה ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. חלץ את ה-DNA הגנומי כדי לשמש מטריצה להגברת PCR.
   1. השעו מחדש את הגלולה עם 50 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי DNA, הומוגניזציה והעבירו את כל הנפח בצינור PCR של 0.2 מ"ל. מערבולת וצנטריפוגה בקצרה (דופק למשך 3 שניות).
   2. הנח את הצינור במחזור תרמי וחמם אותו בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. יש לדלל את ה-DNA המופק ב-90 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. מערבולת וצנטריפוגה בקצרה (5,000 x גרם, 3 שניות).
3. לדלל את פריימר ה-PCR (ראה טבלת חומרים) במים טהורים במיוחד לריכוז סופי של 10 מיקרומטר (כלומר, 10 pmol/μL).
4. הכן את תערובת ה-PCR (בהתאם להערה למטה) בצינור PCR של 0.2 מ"ל (נפח סופי = 50 מיקרוליטר, למצב אחד). בדרך כלל, יהיו לפחות שני תנאים: ה- KO והפקד הלא ערוך עם Cas9 בלבד.
   הערה: DNA גנומי מטוהר: 10 מיקרוליטר; פריימר קדימה ואחורה (10 מיקרומטר): 2.5 מיקרוליטר כל אחד, הריכוז הסופי של 500 ננומטר; מאגר תגובה (5x): 10 מיקרוליטר מערבולת הרבה לפני ההוספה. מערבבים dNTP (25 מ"מ מכל אחד): 0.6 מיקרוליטר, ריכוז סופי של 0.3 מ"מ לכל dNTP. DNA פולימראז: 0.5 מיקרוליטר; מים טהורים במיוחד: 23.9 מיקרוליטר מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר (דופק למשך 3 שניות).
5. הנח את הצינורות במחזור התרמי והפעל את תוכנית ה-PCR עם ההגדרות הבאות:
   הערה: מחזור אחד ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו 30 מחזורים [98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות (שלב דנטורציה), X מעלות צלזיוס למשך 15 שניות (שלב חישול), 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (שלב התארכות)], ואז מחזור אחרון אחד ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. בתום ההגברה, הסר את הצינורות, המערבולת והצנטריפוגה לזמן קצר (דופק למשך 3 שניות). טמפרטורת החישול (X) היא טמפרטורת ההיתוך (Tm) של הפריימרים מינוס 5 מעלות צלזיוס.
6. לאוכלוסייה ערוכה רב-שבטית: בשפופרת חדשה של 0.2 מ"ל, הוסף 17.5 מיקרוליטר של אמפליקון PCR ו-2 מיקרוליטר של NEBuffer 2 (פי 10) לנפח סופי של 19.5 מיקרוליטר. מערבולת וצנטריפוגה בקצרה (דופק למשך 3 שניות). לחלופין, כדי לסנן שיבוטים של תא בודד, ערבב 1:1 מתוצרי ה-PCR הן מתאי הבקרה הערוכים והן מתאי הבקרה הלא ערוכים (שלב 5.6) (איור משלים 1).
7. עבור היווצרות ההטרו-דופלקס, הנח את הצינורות במחזור התרמי והפעל את התוכנית הבאה: מחזור אחד ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, אחד עם רמפה של -2 מעלות צלזיוס לשנייה מ-95 עד 85 מעלות צלזיוס, אחד עם רמפה של -0.3 מעלות צלזיוס לשנייה מ-85 עד 25 מעלות צלזיוס ומחזור קירור סופי אחד ב-10 מעלות צלזיוס ב-HOLD.
8. לאחר היווצרות ההטרודופלקס, הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסת T7EI לתוך הצינור. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
9. הכינו ג'ל אגרוז 1.2%:
   1. שקלו את האגרוז בבקבוק זכוכית והוסיפו את הנפח המתאים של מאגר TAE 1x (40 מ"מ טריס-אצטט, 1 מ"מ EDTA, pH 8.3). הכניסו אותו למיקרוגל, שימו לב לא להבריג את המכסה בחוזקה. מחממים מספר פעמים עד שגבישי האגרוז מומסים לחלוטין.
      הערה: במידת הצורך, מערבבים את התמיסה. אל תאפשר לו לרתוח, אחרת הנפח יקטן, וישנה את ריכוז האגרוז.
   2. מוסיפים את כתם ג'ל ה- DNA המדולל ב -1/20,000 ומערבבים היטב.
   3. יוצקים את תמיסת האגרוז לתבנית, מוסיפים מסרק ומניחים להתמצק בטמפרטורת החדר.
10. הכינו דגימות לאלקטרופורזה של ג'ל על ידי ערבוב של 5 מיקרוליטר של מוצרי העיכול T7EI (שלב 5.9) או מוצר ה-PCR הלא מעוכל עם 5 מיקרוליטר מים ו-2 מיקרוליטר של צבע טעינת DNA פי 6. טען את הדגימות ואת סולם הגודל והעבר ב-80 וולט למשך 45 דקות (ניתן להתאים את הזמן בהתאם לגודל הצפוי של שברי ה-DNA). לאחר סיום הנדידה, רכשו תמונה של הג'ל עם מערכת הדמיה מתאימה.

6. אימות עריכת גנים על ידי ניתוח ריצוף סנגר (איור 1.6)

1. כדי לאפיין את השינוי הגנטי, יש לטהר את תוצרי ה-PCR (שלב 5.4) ולאחר ריצוף סנגר, לנתח את התוצאות באמצעות כלי ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
2. לשלוט אם ניתן לייצר חלבון למרות השינויים.
   1. הורד את תוצאות ה-ICE ופתח את קובץ contribs.txt.
   2. השווה את הרצפים הערוכים עם המקביל של WT. מפה את האינדלים וודא שהם נוצרו באזור הגנומי הממוקד. העריכו את גודלם. אם אורך האינדל אינו כפולה של שלוש, יתרחש שינוי מסגרת, וייתכן שיוצג PTC. ה-mRNA המוטנטי צפוי לעבור פירוק בתיווך NMD.

7. בידוד שיבוט של תא בודד על ידי הגבלת דילול (איור 1.7)

הערה: בידוד של שיבוטים חד-תאיים אינו חובה. עם זאת, אם בוחרים לעשות זאת, חשוב לאפיין שיבוטים מרובים ולהשוות את הפנוטיפ שלהם לאוכלוסייה הפוליקלונית המקורית.

1. קח דגימה של תרחיף תאים, דלל אותה 1/2 עם מדיום תרבית והעריך את הריכוז (שלב 2.7.1). דילול מגדיל את דיוק הספירה.
2. בצע 2 עד 3 שלבי דילול סדרתי כדי להגיע לריכוז של 7 תאים/מ"ל. הוצא 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לבאר בצלחת עגולה תחתונה של 96 בארות (כלומר, 0.7 תאים לבאר). הניחו לתא להתרוקן במשך כמה שעות לפני שאתם מתבוננים בלוחות במיקרוסקופ כדי לזהות בארות המכילות תא אחד.
3. עקוב באופן קבוע אחר היווצרות וצמיחה של מושבה והעביר תאים לצלחת תרבית גדולה יותר או לבקבוק בעת הצורך.

8. אפיון פונקציונלי של תאי THP-1 KO SAMHD1 על ידי בדיקת הגבלת HIV-1

1. זרע THP-1 בצלחת תרבית של 24 בארות עם 0.25 x 10⁶ תאים לבאר ב-300 מיקרוליטר של RPMI בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (RPMI מלא) ומכיל 300 ננוגרם/מ"ל PMA להתמיינות. שמור את הצלחת באינקובטור לח (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) למשך 24 שעות.
2. החלף את המדיום במדיום RPMI שלם ללא PMA והחזיר את הצלחת לחממה למשך 24 שעות נוספות.
3. בעזרת משאבת ואקום, שאפו את כל מדיום התרבות. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסה המכילה מלאי ויראלי HIV-1-GFP פסאודוטיפ VSVg (MOI = 0.5 IFU/תא). כלול בקרה שאינה נגועה. הנח את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לסנכרן את הזיהום.
4. שטפו את התאים פעם אחת עם RPMI. הוסף 500 מיקרוליטר של RPMI שלם לכל באר ודגר במשך 48 שעות בתנאים סטנדרטיים (ניתן לכוונן את הזמן).
5. לאחר הסרת מדיום התרבית, יש לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS קר 1x. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA בכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מנותקים לחלוטין (5 דקות אמורות להספיק) לפני הוספת 200 מיקרוליטר של RPMI מלא כדי לנטרל את האנזים. העבירו 250 מיקרוליטר מכל באר לצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות (ודא שציטומטר הזרימה מקבל לוחות תרבית).
6. צנטריפוגה את הצלחת (757 x גרם, 3 דקות, האטה = 6, 20 מעלות צלזיוס) ושואבים את הסופרנטנט באמצעות פיפטה רב-ערוצית. השעו מחדש את הגלולה עם 100 מיקרוליטר של 4% PFA ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף 100 מיקרוליטר PBS קר 1X.
7. לנתח את שיעור ההדבקה, המיוצג על ידי תאים חיוביים ל-GFP, על ידי ציטומטריית זרימה (ראה איור משלים 2 לאסטרטגיית שער מוצעת).

קו תאים THP-1 נוצר ביציבות המבטא את חלבון מדווח GFP (THP-1_GFP) (איור 2A) ושימש ככלי להקמת פרוטוקול למהדורת גנים יעילה בתיווך CRISPR-Cas9. למטרה זו, 3 sgRNA המכוונים לגן EGFP תוכננו עם כלי האינטרנט CRISPOR²⁹ (איור 2B), אשר הורכבו בו זמנית עם Cas9 ביחס מ...

כאן, מתואר פרוטוקול להשגת עריכה מוצלחת בתיווך CRISPR של קו התאים THP-1. הגישה מסתמכת על העברה של sgRNA/Cas9 RNPs שהורכבו מראש על ידי אלקטרופורציה/נוקלאופציה. אסטרטגיה זו נבחרה כדי להגביל את ההשפעות מחוץ למטרה שעלולות להתעורר עם אינטגרציה מתווכת לנטיוויראלית של קלטת sgRNA/Cas9, המניבה בי?...

לכל המחברים אין ניגודי אינטרסים.

אנו אסירי תודה לג'יי.פי קונקורדה (MNHN, U1154/UMR7196, פריז), ג. בוסיס (IGMM, מונפלייה) וד. שלוטר (בית הספר לרפואה של הנובר, גרמניה) על שיתוף הפרוטוקולים ועל הדיון. פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 101017572 ל-AZ) ו-ANRS (מענק ECTZ162721 ל-AZ). מודל המחלות הזיהומיות ותשתית המחקר של טיפולים חדשניים (IDMIT) נתמכת על ידי "תוכנית השקעה ד'אווניר (PIA)" תחת הפניה ANR_11_INSB_0008.