JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקול כללי ותכנון שיטתי שניתן ליישם כדי להפריד ולזהות רכיבים מורכבים בצמח האלפינית, Achillea millefolium L., רפואת צמחים סינית.

Abstract

רפואת הצמחים הסינית היא מורכבת ויש לה תרכובות רבות לא ידועות, מה שהופך את המחקר האיכותני לקריטי. ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה מרובע כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC-Q-TOF-MS) היא השיטה הנפוצה ביותר בניתוח איכותי של תרכובות. השיטה כוללת פרוטוקולים סטנדרטיים ומתוכנתים לטיפול מקדים בדגימה, כוונון MS, רכישת MS ועיבוד נתונים. הטיפולים המקדימים לדגימות כוללים איסוף, ריסוק, מיצוי ממסים, אולטרסאונד, צנטריפוגה וסינון. עיבוד הנתונים לאחר מכן תואר בפירוט וכולל ייבוא נתונים, בניית מסד נתונים עצמי, הקמת שיטות, עיבוד נתונים ופעולות ידניות אחרות. החלק שמעל הקרקע של צמח היארו האלפיני, Achillea millefolium L., משמש לטיפול בדלקות, הפרעות במערכת העיכול וכאבים, ו-3-oxa-guaianolides שלו יכולים להיות מובילים שימושיים לפיתוח תרופות אנטי דלקתיות. זוהו שלוש תרכובות מייצגות ב-AML, המשלבות TOF-MS עם מסד נתונים שהוקם בעצמו. יתר על כן, נדונו ההבדלים מהספרות הקיימת, אופטימיזציה של פרמטר פאזה נוזלית, בחירת מצב סריקה, התאמת מקור יונים, התאמת אנרגיית התנגשות, סינון איזומרים, מגבלת שיטה ופתרונות אפשריים. שיטת ניתוח סטנדרטית זו היא אוניברסלית וניתן ליישם אותה לזיהוי תרכובות מורכבות ברפואת צמחי מרפא סינית.

Introduction

הרפואה הסינית צברה את הידע האמפירי העשיר ביותר בעולם1. ניתוח איכותני של רכיבים כימיים ברפואת צמחי מרפא סינית מסורתית הפך לנושא מכריע במחקר2. קשה להבחין בהבדלים כימיים ברפואת צמחי מרפא סינית בגלל מורכבות הקטגוריה וגיוון המקור3. סוגי התרכובות העיקריים ברפואת הצמחים הסינית כוללים אלקלואידים, ספונינים, פלבנואידים, אנתרקינונים, טרפנואידים, קומרינים, ליגננים, פוליסכרידים, פוליפפטידים וחלבונים1. עם זאת, הפרדת תרכובות וזיהוי איזומרים מעכבים את התפתחות המחקר האיכותני על רפואת צמחי מרפא סינית.

השילוב של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC) עם עמודות כרומטוגרפיה מתאימות מספק תמיכה חזקה להפרדת תרכובות מורכבות ברפואת צמחי מרפא סינית4. בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הפכה פופולרית יותר ויותר בניתוח איכותני של רפואת צמחי מרפא סינית. שיטות נפוצות לספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה כוללות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה מרובע (Q-TOF-MS)5, ספקטרומטריית מסה אורביטראפית (Orbitrap-MS)6 וספקטרומטריית מסה ציקלוטרון יונים פורייה (FT-ICR-MS)7. ל-FT-ICR-MS יש את הרזולוציה הגבוהה ביותר אך כרוכה בעלויות תפעול ותחזוקה יקרות8. ל-Orbitrap-MS יתרונות בזיהוי תרכובות מולקולריות קטנות, במיוחד במשקלים מולקולריים מתחת ל-500 Da9. Q-TOF-MS היא השיטה הנפוצה ביותר בניתוח איכותני של פרמקוכימיה בסרום 10,11. בהשוואה למסד הנתונים המסורתי של הרשת או למסד הנתונים המסחרי, ניתוח משותף עם מסד נתונים שהוקם בעצמו לעיבוד נתונים הפך פופולרי יותר ויותר.

צמח העץ האלפיני, Achillea millefolium L. (AML), סוג של רפואת צמחי מרפא סינית, גדל בעיקר בשינג'יאנג, מונגוליה הפנימית ובאזורים הצפון-מזרחיים של סין12. החלק העילי של AML נמצא בשימוש נרחב לטיפול בדלקות, הפרעות במערכת העיכול וכאבים, כולל שיגרון, כאבי שיניים וכאבי בטן13. 3-oxa-guaianolides מ-AML מציעים פוטנציאל גדול כמובילים לפיתוח תרופות אנטי דלקתיות14. מחקרים עדכניים על רכיבים כימיים ב-AML מתמקדים בססקיטרפנים, מונוטרפנים, פלבנואידים ותרכובות פנוליות15. עם זאת, לזיהוי תרכובות ב-AML, לא קיימת תוכנית אינדוקציה איכותית שיטתית שיכולה לשמש לתרופות צמחיות סיניות אחרות. מחקר זה נועד לספק זיהוי סטנדרטי של רכיבים כימיים ברפואת צמחי מרפא סינית על ידי שילוב של Q-TOF-MS וניתוח מסדי נתונים עצמיים.

Protocol

1. טיפול מקדים לדוגמא

  1. אוסף צמחי מרפא סיניים AML
    1. שתלו זרעי עשב יארו אלפיני, Achillea millefolium L. (AML) באדמה בפברואר. אספו את החלק העילי של AML ביולי של אותה שנה (איור 1A).
      הערה: AML ששימשה במאמר זה נאספה באזור הררי בגובה של 400 מ' במיאניאנג, סצ'ואן, סין.
  2. טיפול ייבוש
    1. שטפו את כל ה- AML שנאסף במים טהורים כדי להסיר משקעים וזיהומים. יבש את ה-AML בתנור בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות (איור 1B).
  3. הכנת אבקה
    1. לאחר הייבוש, מועכים AML לאבקה גסה בעזרת מגרסה רב תכליתית במהירות גבוהה. העבירו את האבקה דרך מסננת של 50 רשת (איור 1C).
  4. מיצוי ממס
    1. הניחו 1 גרם של דגימת AML בשקילה מדויקת בבקבוק חרוטי עם 30 מ"ל של תמיסת אתנול-מים של 75% (איור 2A).
    2. חלץ את התערובת בסוניקטור אמבט אולטרסאונד למשך 30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס (איור 2B).
    3. צנטריפוגה של הדגימה ב-14,000 × גרם למשך 5 דקות (איור 2C).
    4. התקינו מזרק הזרקה עם מסנן ממברנה מיקרו-נקבובית (0.22 מיקרומטר, אורגני בלבד) וסננו את הסופרנטנט לתוך בקבוק דגימה של 2 מ"ל (איור 2D).

2. מנגינת MS

  1. הפעל את תוכנת הבקרה LC-MS (איור 3A). פתח את מודול MS tune ונקה את תמיסת 1 ננוגרם/מיקרוליטר לאוצין אנצפלין (LE) פעמיים.
  2. בלוח בקרת זרימת LockSpray , הגדר קצב זרימה של 50 μL/min ולחץ על כפתור הזרימה כדי לאפשר לתמיסת LE להיכנס לספקטרומטר המסה (איור 3B).
  3. לחץ על כפתור הגדרת מקור LockSpray כדי להשלים את כוונון MS במצב חיובי (איור 3C). לחץ על הסמל השלילי כדי להחליף את מצב היונים. לחץ על כפתור הגדרת מקור LockSpray כדי להשלים את מנגינת MS במצב שלילי.

3. רכישת MS

  1. הגדר טבלת רצף, כולל שם קובץ, שיטת MS, קובץ כניסה, בקבוקון ואמצעי אחסון. לחץ על כפתור שמור כדי להקליט את טבלת הרצף.
  2. לחץ על כפתור ההפעלה וכפתור התחל ברצף (איור 3D). בחר באפשרות השגת נתונים לדוגמה בלבד . לחץ על כפתור אישור כדי להתחיל ברכישת נתונים.
  3. לחצו על כפתור הכרומטוגרמה כדי לפתוח את חלון כרומטוגרמת היונים הכוללת (TIC) בזמן-אמת (איור 3E). לחץ על כפתור התצוגה וכפתור TIC ברצף. בחר באפשרות כרומטוגרמה של BPI , ולאחר מכן לחץ על כפתור אישור כדי להציג את חלון כרומטוגרמת שיא הבסיס (BPI) (איור 3F).

4. עיבוד נתונים

  1. הפעל את תוכנת ניתוח הנתונים.
  2. לחץ על כפתור העבודה שלי ועל כפתור ייבוא נתוני MassLynx בתורו כדי להיכנס לחלון הצאצא (איור 4A). בחר את קבצי הנתונים הגולמיים והזן את שם הערכה לדוגמה, ולאחר מכן לחץ על צור ערכת דוגמאות של UNIFI כפתור כדי לייבא את הנתונים הגולמיים של ספקטרום MS.
    הערה: ודא שהנתונים הגולמיים החיוביים והשליליים מיובאים בנפרד.
  3. הקמת מאגר מידע
    1. לחץ על כפתור הניהול בחלון הראשוני (איור 4B). לחץ על הלחצן ייבוא פריטי ספרייה . בחר את קובץ תבנית מסד הנתונים בתבנית .xlsx עם כל המבנים המורכבים המופרדים בתבנית .mol באותה תיקיה.
    2. הזן שם עבור מסד הנתונים. לחץ על כפתור Verify כדי לוודא שכל התרכובות מוצגות. לחץ על כפתור הייבוא כדי לסיים את הבנייה של מסד נתונים שהוקם בעצמו.
      הערה: כל התרכובות בקבצים בפורמט .mol עצמאיים שיש לייבא למסד הנתונים מוכנות על סמך הפניות לספרות. קבצי מבנה מורכבים מצוירים בעצמך באמצעות תוכנת ציור.
  4. לחץ על כפתור צור שיטת ניתוח כדי לפתוח חלון צאצא. לחץ על כפתור צור שיטת תהליך בלבד כדי ליצור שיטת עיבוד נתונים.
  5. ניתוח נתונים
    1. לחץ על כפתור צור ניתוח כדי לפתוח חלון צאצא.
    2. לחץ על כפתור צור ניתוח מנתונים קיימים , ולאחר מכן בחר את הנתונים המיובאים ואת השיטה שהוקמה.
    3. לחץ על כפתור התהליך כדי להתחיל חישוב נתונים ארוך (איור 4D).
    4. לחץ על כפתור החקירה כדי לעבור לחלון TIC.
    5. לחץ על כפתור בחר עקבות ובחר ב-TOF MSE BPI. לחץ על כפתור החלף הכל כדי להציג את ה-BPI.
  6. לחץ לחיצה ימנית ובחר באפשרות הוסף עמודה | הצג מידע מורכב, כולל שם תרכובת, מסה טבעית, m/z נצפה, שגיאת מסה, זמן שימור נצפה (RT), ספירת גלאים, תגובה, תוספות, הקצאות חלופיות ומספר כולל של שברים שנמצאו (איור 4E).
  7. בחר באפשרות שברי אנרגיה גבוהה כדי להציג את מקטעי ספקטרום המסה המשניים של התרכובת שנבחרה (איור 4F).
  8. צייר ידנית את נתיבי המחשוף המולקולרי בהתאם לכל מקטע משני (איור 4G).
    הערה: הדוגמאות מתוארות בפירוט בסעיף התוצאות המייצגות.

תוצאות

עשב יארו אלפיני שימש כמודל להצגת התוצאה המייצגת. כפי שמוצג באיור 4G, קוורצטין-3'-O-גלוקוזיד עם m/z = 463.08935 הפך למתווך עם m/z = 300.02828 באמצעות אובדן מולקולת הקסוזה במהלך תגובת ההידרוליזה. במסלול אחר, שבירת קשר ה-C-C בשלד המבנה הפלבנואיד הובילה להיווצרות ביניים עם m/z = ...

Discussion

ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה בשילוב עם מסד נתונים שהוקם בעצמו מציעה טכנולוגיה איכותית שיטתית לזיהוי רכיבים כימיים ברפואת הצמחים הסינית. בניגוד למאגר מידע מסחרי, המכיל רפואה סינית מסורתית נפוצה, מסד נתונים עצמאי המשתמש בתרכובות המדווחות בספרות מספק דיוק רב יותר בנ?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (2022MD713780), צוות התורשה והחדשנות של טיפול ברפואה סינית מסורתית במחלות חיסוניות, פרויקט המחקר המדעי הרפואי של צ'ונגצ'ינג (פרויקט משותף של ועדת הבריאות של צ'ונגצ'ינג ולשכת המדע והטכנולוגיה) (2022DBXM007), והקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (cstc2018jcyjAX0370). פרויקט מיוחד לתמריץ ביצועים והדרכה של מכון המחקר המדעי של צ'ונגצ'ינג (cstc2022jxjl120005, cstc2021jxjl130021).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethyl acetateChuandongChemicalCAS 141-78-6
liquid chromatographWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-butyl alcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleum etherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometryWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData analysis software

References

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689 (2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889 (2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822 (2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242 (2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433 (2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733 (2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647 (2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -. J., Liao, X., Kuang, H. -. M., Li, J. -. Y., Zhang, S. -. H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360 (2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823 (2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -. L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145 (2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

UPLC Q TOF MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved