Nos recherches visent à comprendre le rôle du système nerveux dans la progression de l’athérosclérose. Plus précisément, à chaque interaction avec la crête, nous visons à répondre à la question de savoir comment le nerf change pendant l’athérosclérose et comment son interaction influence la progression de la maladie. Plusieurs technologies de pointe sont actuellement utilisées pour faire avancer la recherche sur l’athérosclérose afin d’améliorer la compréhension des mécanismes de la maladie.
Il s’agit notamment du nettoyage des tissus et de l’imagerie 3D, des techniques microscopiques avancées, de l’intelligence artificielle, du séquençage de cellules uniques et de l’apprentissage automatique. Au cours de la progression de l’athérosclérose, les composants de la paroi artérielle subissent une restructuration robuste. La délimitation des changements en 3D et l’imagerie haute résolution des tissus intacts sont les principaux défis expérimentaux.
Les outils d’imagerie décrits ici aideront les chercheurs et les cardiologues à mieux comprendre la maladie et, éventuellement, à traiter les patients. Le protocole décrit ici offre plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles telles que l’imagerie des tissus profonds des tissus intacts, ainsi que la visualisation de leur structure qui sont autrement inaccessibles. Ces protocoles aideront à mieux comprendre l’interaction cellule-cellule et cellule-tissu afin d’améliorer la compréhension de la progression de la maladie.
La visualisation des changements cellulaires et structurels en 3D dans les tissus intacts peut fournir de nouvelles informations pour mieux comprendre les questions biologiques sans réponse dans la recherche cardiovasculaire. Pour commencer, placez la souris anesthésiée sur une plaque de mousse recouverte d’essuie-tout chirurgical. Fixez les bras et les jambes de la souris en position couchée à l’aide de rubans adhésifs.
Désinfectez la poitrine avec de l’éthanol à 75 %. Prélevez le sang du ventricule gauche à l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre. Faites ensuite une incision médiane sur la poitrine et une petite incision dans l’oreillette droite.
Perfuser le ventricule gauche de la souris avec 10 millilitres d’EDTA de cinq millimolaires dans le PBS pendant cinq minutes jusqu’à ce que le sang soit évacué, suivi de 20 millilitres de PBS pendant 5 à 10 minutes. Enfin, perfuser avec 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes. À l’aide d’un stéréomicroscope à dissection, retirez les organes internes, y compris les organes gastro-intestinaux et reproducteurs.
Laissez le cœur, l’aorte et les reins intacts. Ensuite, retirez soigneusement le thymus et le tissu adipeux environnant. Exposez toute l’aorte, de l’aorte ascendante à la bifurcation iliaque.
Récoltez toute l’aorte et placez-la dans une boîte de Pétri remplie de PBS. Séparez l’aorte en différents segments et divisez-la longitudinalement pour deux nettoyages de 2, 2' thiodiéthanol ou TDE. Fixez l’aorte de la face terminale sur une plaque de cire noire plate en forme de Y et fixez-la dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, détachez l’aorte et transférez-la dans du PBS pour un lavage de cinq minutes. Transférez ensuite l’aorte dans une solution bloquante pendant deux heures pour le blocage et la perméabilisation. Ensuite, incubez l’aorte avec des anticorps primaires dans la solution bloquante pendant 24 heures.
Lavez l’aorte dans du PBS pendant cinq minutes, en répétant cinq fois avant de l’incuber avec des anticorps secondaires dans du sérum d’âne normal à 10 % et du DAPI pour la coloration nucléaire pendant la nuit, transférez l’aorte colorée dans une concentration croissante de solution TDE. Ensuite, collez bien l’espaceur d’imagerie rectangulaire collant double face sur une lame de verre propre et transférez l’aorte dégagée, en vous assurant que l’adventice aortique de l’extrémité fait face à la lamelle. Montez l’aorte avec des gouttes de solution à 60 % de TDE et fixez soigneusement une lamelle au puits en évitant les bulles d’air.
Allumez le microscope confocal à balayage laser inversé équipé d’un objectif à immersion dans l’huile 20x. Réglez les détecteurs à diodes hybrides en fonction des colorants de coloration. Ajustez les paramètres d’affichage et sélectionnez le format XY 1024 x 1024 pixels pour l’imagerie.
Déposez de l’huile d’immersion sur la lamelle et déplacez grossièrement l’objectif 63x vers l’échantillon jusqu’à ce qu’il touche l’huile d’immersion et la lamelle. Ensuite, identifiez la région d’intérêt et acquérez des empilements Z du côté adventice de l’aorte à une taille de pas de deux à quatre micromètres jusqu’à une profondeur de 60 micromètres pour l’imagerie tridimensionnelle. Nommez le fichier avec les détails de l’échantillon, analysez les détails et enregistrez les données.
À l’aide d’un microscope multiphotonique droit équipé d’un objectif 20x, acquérez des empilements Z du côté abluminal à une taille de pas de 10 à 15 micromètres jusqu’à une profondeur de 700 micromètres. Après avoir anesthésié et perfusé la souris avec du PBS et du paraformaldéhyde, disséquez la partie du corps au-dessus du niveau du diaphragme. Fixez la partie inférieure du corps avec 4 % de paraformaldéhyde pendant un à deux jours à quatre degrés Celsius.
Ensuite, lavez soigneusement l’échantillon dans du PBS pendant 10 minutes, en répétant trois fois. Incuber l’échantillon dans une solution cubique à 20 % pendant 48 heures. Après le lavage au PBS, incuber l’échantillon dans une solution de PGST pendant la nuit pour la perméabilisation et le blocage.
Le lendemain, incubez l’échantillon avec les anticorps primaires dans une solution de PGST à quatre degrés Celsius en agitant doucement pendant 10 à 12 jours. Après avoir lavé l’échantillon dans PGST, ajoutez des anticorps secondaires dans DAPI dans PGST à quatre degrés Celsius pendant sept jours. Lavez soigneusement l’échantillon dans PGST pendant une heure, en répétant cinq fois.
Transférez l’échantillon coloré dans une série de concentrations accrues de solutions de travail de tétrahydrofurane pour la déshydratation, en incubant 12 heures par concentration. Après déshydratation, placez l’échantillon dans une solution absolue de dichlorométhane pendant trois heures pour l’élimination des lipides. Ensuite, incubez l’échantillon dans une solution de benzoate d’alcool benzylique correspondant à l’indice de réfraction pendant trois à six heures.
Pour commencer, chargez les images en mosaïque Z de l’aorte de la souris et des parties inférieures du corps sur le poste de travail de traitement d’images. Pour coder par couleur la profondeur volumique d’une cellule ou d’une structure, utilisez un logiciel de restauration d’image pour déconvoluer l’image brute. Dans le logiciel Fidji, générez une projection d’intensité maximale des données déconvulquées à l’aide du codage couleur temporel.
Chargez la série d’images TIFF en mosaïque Z dans le logiciel. À l’aide du plugin d’assemblage Fidji, assemblez les images et enregistrez-les au format TIFF. Ensuite, chargez les images assemblées dans un logiciel de visualisation tridimensionnelle pour la segmentation des images.
Tracez manuellement les structures neuronales dans l’axe X-Y-Z le long de tout le chemin entre l’aorte et les ganglions. Chargez des images prétraitées dans un logiciel d’analyse d’images. Utilisez l’autofluorescence pour segmenter l’aorte et les tissus conjonctifs.
Appliquez des pseudo-couleurs distinctes pour visualiser la paroi aortique et la plaque distinctes. Enfin, utilisez la fonction d’égalisation d’histogramme adaptative à contraste limité pour améliorer le contraste local sur l’arrière-plan des images traitées. L’aorte athéroscléreuse éliminée par TDE a révélé des lymphocytes T colorés au CD3e dans les plaques, une néogenèse étendue des fibres nerveuses colorées au NF200 dans les organes lymphoïdes tertiaires artériels.
L’imagerie multiphotonique de l’aorte abdominale malade chez des souris knock-out APOE a montré une germination axonale exprimant NF200 dans des régions dépourvues de lymphocytes B positifs B220 dans les organes lymphoïdes tertiaires artériels. L’imagerie à feuillet lumineux de l’abdomen de souris dégagée par iDISCO a permis de visualiser la relation spatiale entre l’aorte et les ganglions sympathiques avec des axones nouvellement formés et colorés à NF200 sur l’adventice adjacente à la plaque d’athérosclérose.
