Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris

Les exosomes dérivés des tissus ont attiré de plus en plus d’attention en raison de leur capacité à refléter avec précision la spécificité des tissus et le microenvironnement. Notre recherche s’est concentrée sur la compréhension des rôles fondamentaux et translationnels des exosomes dérivés de la rate dans les maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous développons un protocole pratique pour isoler les exosomes des tissus de la rate de souris, fournissant une technique reproductible pour l’analyse d’identification ultérieure et les études fonctionnelles.

Nous utilisons une collagénase de type I pour la digestion, suivie d’une filtration par ultracentrifugation différentielle pour produire un exosome de rate de haute qualité. Contrairement aux rapports précédents, en utilisant l’homogénéisation tissulaire pour obtenir une suspension tissulaire, notre approche préserve l’intégrité membranaire des cellules dans les tissus. Cette technique pourrait être particulièrement utile pour étudier le rôle des exosomes dans les réponses immunitaires.

Compte tenu de la fonction critique de la rate dans le système immunitaire, des études futures pourraient adapter ce protocole aux tissus humains, permettant l’extraction d’exosomes cliniquement pertinents à des fins diagnostiques et thérapeutiques. Pour commencer, prérefroidissez les centrifugeuses à grande vitesse et à ultra-haute vitesse à quatre degrés Celsius et réglez la température de l’agitateur de bureau à 37 degrés Celsius. Préparez les boîtes de culture cellulaire d’un diamètre de 100 millimètres.

Ensuite, disposez des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres, de la glace et des crépines de cellules stériles d’un diamètre de 70 micromètres. Vaporisez de l’alcool à 75 % pour stériliser les ciseaux et les pinces et chauffez-les à haute température pour stériliser davantage. Ensuite, placez le tissu de la rate dans une boîte de Pétri stérile de 100 millimètres sur de la glace et lavez le sang de surface avec du PBS 1X froid.

Séchez soigneusement la rate avec de la gaze stérile avant de peser les tissus. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert stérile, ajoutez un millilitre de PBS dans une crépine de cellules de 70 micromètres pour l’humidifier. Enfin, préparez 0,1 % de collagénase de type I dans 1X PBS avec un mélangeur vortex pour obtenir le tampon de digestion.

Pour commencer, préparez les réactifs et les outils stériles pour le traitement des tissus. À l’aide de ciseaux, coupez le tissu de la rate en petits morceaux uniformes dans une boîte de culture sur de la glace et transférez-les dans un tube à centrifuger de 50 millilitres à l’aide d’une pipette de transfert stérile. Ensuite, ajoutez le tampon de digestion dans le tube en fonction du poids du tissu de la rate et secouez le tube à un angle de 45 degrés sur un agitateur horizontal réglé à 37 degrés Celsius.

Arrêtez la digestion lorsque les morceaux de tissu se sont dispersés et que la plupart des morceaux ont perdu leur forme. Transférez le mélange digéré à travers une passoire à cellules de 70 micromètres à température ambiante pour éliminer les débris tissulaires fibreux et plus gros. Recueillir le filtrat dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres.

Centrifuger le filtrat à 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et répétez l’étape de centrifugation à des vitesses appropriées. Après l’ultracentrifugation, jetez le surnageant et lavez la pastille avec du PBS.

Ultracentrifugeuse à nouveau à 120 000 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius pour isoler les exosomes. Enfin, dissolvez les exosomes isolés dans 200 microlitres de PBS stérile par rate et stockez-les dans un tube à centrifuger de deux millilitres à moins 80 degrés Celsius. Les images de microscopie électronique à transmission ont révélé la présence de vésicules en forme de coupe avec une bicouche lipidique, caractéristique des exosomes.

La taille des exosomes variait de 30 à 150 nanomètres, avec une concentration maximale de 60 nanomètres, comme le montre le graphique de distribution de taille. L’analyse par transfert Western a confirmé la présence de marqueurs exosomaux, TSG101 et CD9, tandis que GM130 et le témoin négatif n’ont pas été détectés.