La portée de notre recherche consiste à développer et à valider une méthode non invasive pour mesurer la teneur en carbone dans les macrophages des voies respiratoires en tant que biomarqueur de l’exposition aux particules contenant du carbone. Notre objectif est de déterminer l’exactitude et la fiabilité de cette méthode d’évaluation de l’exposition individuelle à grande échelle. Notre protocole fournit une méthode non invasive, précise et standardisée pour mesurer la teneur en carbone dans les macrophages des voies respiratoires.
En tant que biomarqueur de l’exposition interne, il s’agit d’une exposition individuelle efficace et précise aux particules contenant du carbone. Notre protocole offre un biomarqueur direct et fiable pour l’exposition individuelle aux particules contenant du carbone. Cette méthode permet une quantification à grande échelle à l’aide d’expectorations induites, ce qui améliore à la fois la précision et la fiabilité par rapport à d’autres techniques.
Commencez par prélever un échantillon d’expectoration de deux millilitres dans un tube à centrifuger. Ensuite, ajoutez 20 à 30 millilitres de la solution fixatrice préparée dans le tube et mélangez bien le contenu. Pour préparer la solution digestive pour la suspension cellulaire, dissolvez 0,1 gramme de dithiothréitol dans 100 millilitres de solution saline, selon la posologie requise.
Maintenant, centrifugez le tube contenant les expectorations à 1 998 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant. Ajouter un volume égal de digestat d’expectoration au précipité.
Agitez et secouez soigneusement le mélange. Ensuite, placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à liquéfaction complète. Ensuite, filtrez le mélange liquéfié à l’aide d’une membrane filtrante de 70 micromètres.
Centrifuger la solution filtrée à 500 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant en maintenant la cellule précipitée. Maintenant, mettez en suspension le précipité cellulaire dans le tampon de phosphate de Duchenne.
Centrifuger la solution à 500 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir un précipité cellulaire pur. Pour la préparation du frottis cellulaire, ajoutez 200 à 600 microlitres de tampon phosphate au sédiment cellulaire et mélangez soigneusement. Ensuite, prélevez 20 microlitres de suspension cellulaire et créez un frottis cellulaire.
Fixez le frottis séché avec une solution de coloration disponible dans le commerce pendant 10 secondes. Ensuite, plongez le frottis dans la solution de coloration A pendant huit secondes. Pendant la coloration, soulevez doucement la lame de haut en bas, puis rincez l’excès de tache à l’eau courante.
De petits agrégats de particules de carbone noir distinctement visibles ont été observés à l’intérieur des cellules, variant dans la quantité de particules de carbone. Pour commencer, imagez les lames d’expectorations colorées au microscope. Sélectionnez au hasard des macrophages bien colorés et morphologiquement intacts et capturez leurs images.
À l’aide du logiciel ImageJ, mesurez l’échelle pour une conversion précise des pixels. Sélectionnez Mesurer, puis cliquez sur Définir l’échelle. Entrez la distance en pixels, la longueur réelle et l’unité de longueur, en micromètres.
Ensuite, cochez l’option Global. Maintenant, tracez le contour des cellules avec une forme irrégulière et supprimez l’arrière-plan à l’aide de sélections à main levée. Sous Modifier, sélectionnez Effacer l’extérieur.
Mesurez la surface totale des cellules à l’aide de l’option Analyser et mesurer. Découpez le noyau avec Modifier et Couper. Pour convertir l’image en niveaux de gris en noir et blanc.
Cliquez sur Image, Texte et 8 bits. Pour ajuster la valeur de l’échelle de gris en fonction de la coloration cellulaire afin de compter avec précision les particules de carbone, accédez à Image, choisissez Ajuster, Seuil et Appliquer. Enfin, cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesure.
Les travailleurs de l’emballage du noir de carbone avaient une teneur en carbone plus élevée dans les macrophages des voies respiratoires que le groupe témoin.
