Purification de la chromatine du locus génique en copie unique chez Saccharomyces cerevisiae

Un noyau eucaryote est très encombré avec de nombreux processus biologiques se produisant simultanément. L’objectif de nos recherches est de comprendre comment tous ces processus sont coordonnés sur nos génomes sans accidents majeurs qui conduiraient autrement à l’instabilité génomique et aux maladies humaines. Ce protocole nous permet de purifier un locus spécifique du génome à l’état natif, permettant à la fois la caractérisation compositionnelle et fonctionnelle du matériel isolé, comme la mesure des interactions protéine-ADN.

Ce protocole permet un énorme niveau d’enrichissement d’un locus ciblé, ce qui permet de surmonter de nombreuses limitations actuelles de l’isolement de la chromatine spécifique au locus. Le matériau n’a pas été réticulé. Cela permet également de nombreuses analyses fonctionnelles en aval, telles que la transcription in vitro ou la réplication in vitro.

Ce protocole nous a permis d’exciser et de purifier des origines de réplication distinctes à partir de chromosomes de levure, ce qui nous a permis d’effectuer une analyse protéomique et d’identifier de nouveaux facteurs de chromatine interagissant avec l’origine, et donc de faire progresser le domaine de recherche de la réplication de l’ADN. Ce protocole permet des études de réplication in vitro utilisant le matériau d’origine purifié pour examiner les états de la chromatine, les modifications des histones et effectuer une analyse structurelle sur les matrices nucléosomales natives des chromosomes endogènes, faisant ainsi progresser la recherche sur la chromatine.