Ce protocole fournit une méthode précise et reproductible pour quantifier dix classes lipidiques différentes de Saccharomyces cerevisiae à l’aide d’une méthode d’extraction unique et d’une seule méthode LC-MS. Cette méthode permet la détection et la quantification d’espèces lipidiques isobariques et isomériques ayant des propriétés chimiques et physiques différentes. Pour la culture des cerevisiae saccharomyces, ajoutez d’abord 5 ml de solution stérile de stock de glucose à chacune des deux flacons Erlenmeyer contenant du milieu stérile YNB à une concentration finale de 2 % de glucose.
Ensuite, utilisez une pipette stérile pour transférer un volume d’une culture de levure de nuit contenant cinq fois dix à la septième cellule de levure dans chaque flacon et la culture des flacons pendant au moins 24 heures à 30 degrés Celsius avec rotation secouant à 200 révolutions par minute. Pour l’extraction des lipides, déterminer le nombre total de cellules de levure par millilitre de culture et transférer cinq fois dix à la septième cellule dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Ajouter de l’eau nano-pure glacée pour porter le volume total jusqu’à 15 ml et recueillir les cellules par centrifugation.
Suspendre à nouveau la pastille de levure dans 15 ml de tampon de bicarbonate d’ammonium iso-tonique glacé pour une deuxième centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans 1,5 ml de solution de bicarbonate d’ammonium glacé frais. À la fin de la centrifugation, conserver la pastille à 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction. Pour commencer l’extraction des lipides, décongeler la pastille cellulaire sur la glace avant de suspendre à nouveau les cellules dans 200 microlitres d’eau glacée nano-pure.
Dans une hotte à vapeur, transférer la suspension cellulaire dans un verre à haute résistance de 15 ml, visser le tube de centrifugeuse avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène et ajouter 25 microlitres d’un mélange interne de normes lipidiques, préparé en méthanol chloroforme 2:1. 100 microlitres de 425 à 600 perles de verre lavées à l’acide micromolaire et 600 microlitres d’un méthanol chloroforme 17:1 au tube. Vortex le tube à grande vitesse pendant cinq minutes à température ambiante pour perturber les cellules.
Suivi d’un vortex d’une heure à basse vitesse à température ambiante pour faciliter l’extraction des lipides. À la fin de l’extraction, incuber l’échantillon pendant 15 minutes sur la glace, afin de favoriser les précipitations protéiques et la séparation des phases aqueuse et organique. À la fin de l’incubation, centrifugeuse de l’échantillon pour séparer davantage la phase aqueuse supérieure de la phase organique inférieure et, dans le capot de fumée, utiliser une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure à un nouveau tube centrifugeuse supérieure à vis en verre de 15 ml de haute résistance avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène.
Placez la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté et, dans le capot des vapeurs, ajoutez 300 microlitres d’un mélange de méthanol chloroforme 2:1 à la phase aqueuse supérieure restante. Pour faciliter l’extraction de phosphatidicacid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol et extraction cardio-lipidique vortex le tube vigoureusement pendant cinq minutes à température ambiante avant de centrifuger l’échantillon. Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure dans la phase organique inférieure sous azote et évaporer le solvant dans les phases organiques combinées dans le capot de fumée.
Ensuite, fermez les tubes de film lipidique sous le flux de gaz azoté et stockez les échantillons à 80 degrés Celsius. Pour la chromatographie liquide, séparation des lipides extraits à 500 microlitres d’un mélange d’eau nano-pure de 63:35:5 aceto-nitrile-2-propanol au tube du film lipidique et du vortex trois fois pendant dix secondes par vortex à température ambiante. Soumettons le contenu du tube à la sonication ultrasonique pendant 15 minutes avant de vortexer le tube trois fois pendant dix secondes par vortex comme vient de le démontrer.
Transférer 100 microlitres de l’échantillon dans un flacon de verre avec un insert utilisé pour une plaque de puits 24 et éliminer les bulles dans l’insert. Placez l’insert dans un puits d’une plaque de puits de 24 puits et chargez une colonne CSH de phase C18 inversée couplée à une pré-colonne dans le système de chromatographie liquide. Réglez la température de la colonne à 55 degrés Celsius et le débit à 300 microlitres par minute.
Lorsque tous les paramètres ont été définis, chargez dix microlitres d’une extraction vierge avant de charger le premier échantillon. Ensuite, séparez les différentes espèces lipidiques en utilisant le gradient chromatographie liquide, comme indiqué. Un chromatogramme total représentatif d’ion des données de LC-MS pour les lipides extraits des cellules sera généré.
Pour l’analyse spectrométrique de masse des lipides extraits, chargez les échantillons sur un spectromètre de masse équipé d’une source d’ionisation par électro-pulvérisation chauffée et définissez les paramètres d’analyse tels qu’ils sont décrits dans le tableau. Utilisez l’analyseur Fourier Transform pour détecter les ions parent MS-1 à une résolution de 60 000 et dans la plage de masse de 150-2000 daltons. Ensuite, détectez les ions secondaires MS-2 à l’aide des paramètres indiqués dans le tableau.
Pour identifier et quantifier les différents lipides des fichiers LC-MS en tandem, recherchez gratuitement les fichiers bruts LC-MS contenant des données MS-1 complètes et des données MS-2 dépendantes des données, acides gras non stérilisés, cardio-lipides, phytocerimide, phytosphyngocène, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatydlglycérol, phosphatydlinositol, phosphatydlserine et triacylglycérol classes lipidiques en utilisant une masse divisée par tolérance de charge de cinq parties par million pour les ions précurseurs et dix parties par million pour les ions produits. Ensuite, suivez les instructions fournies dans le manuel de l’utilisateur du logiciel pour identifier les normes lipidiques internes et les espèces lipidiques avec des compositions inhabituelles en acides gras. Cette méthode sensible en tandem LC-MS permet l’identification et la quantification d’espèces moléculaires de lipides à des concentrations aussi faibles que 0,165 picomolaire par microlitre.
Cette limite de quantification diffère des différentes classes lipidiques dans un large éventail de concentrations. Cette méthode peut être utilisée pour augmenter l’efficacité de l’ionisation des lipides en utilisant des additifs de phase mobiles alternatifs pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray. Chacun de ces additifs de phase mobiles alternatifs peut être utilisé à la fois pour la phase normale et les colonnes LC de phase inverse.
La méthode de dissociation induite par collision est bénéfique si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile d’acétium pour le mode négatif d’ionisation électro-pulvérisation de spectrométrie de masse, car, dans ces conditions, il permet l’augmentation de l’efficacité de la fragmentation des ion lipidiques MS-1 en produits MS-2. En revanche, la méthode de dissociation collisionnelle à haute énergie est favorable si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile formate ammonium pour le mode positif de spectrométrie de masse d’ionisation par électro-pulvérisation car dans ces conditions, elle permet une augmentation de l’efficacité de la fragmentation des ion lipidiques MS-1 dans les produits MS-2. Ne mélangez pas les phases lors de la collecte de la phase organique.
Fermer les tubes sous l’écoulement du gaz azoté. Éliminez toute bulle dans l’insert et connectez la colonne dans la bonne direction. Si l’identité d’un pic ne peut être déterminée par la LC-MS, MS-NMR peut être utilisé pour déduire la structure de cette molécule.
