Notre protocole présente une méthode très efficace et facilement reproductible pour quantifier l’ADN simple brin, qui est un marqueur du stress de réplication dans une variété de lignées cellulaires. De plus, sa simplicité permet des applications et des écrans à haut débit. Cette méthode permet notamment de quantifier rapidement un stress de réplication, caractéristique de plusieurs cancers de l’ovaire.
Il se prête également à un logiciel d’analyse automatique hôte, ce qui augmente encore l’efficacité. L’ADN simple brin est maintenant activement considéré comme un biomarqueur de la réponse à la chimiothérapie ciblant les voies de réparation de l’ADN. Par conséquent, cette méthode est très applicable dans ce scénario.
Le stress de réplication existe au-delà des contextes de cancer de l’ovaire ou de cancers déficients BRCA1, BRCA2. Et ainsi, cette méthode peut être appliquée à un large éventail d’autres types de cellules ou contextes de maladies. Pour commencer, faites des feuillets de couverture enduits de polylysine en ajoutant des feuillets de couvercle autoclavés de 12 millimètres de diamètre et une solution de polylysine à un tube conique de 50 millilitres, et placez-les sur une bascule pendant 15 minutes.
Aspirer la solution sur une hotte de culture tissulaire. Lavez les lamelles de couvercle en ajoutant de l’eau stérile et replacez le tube contenant les lamelles de couvercle sur la bascule pendant cinq minutes. Après avoir lavé les feuillets de couvercle trois fois, aspirez l’eau du tube et étalez les feuillets de couvercle sur un plat stérile.
Aspirez l’eau restante et laissez-les sécher dans le capot de culture tissulaire pendant une heure ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gouttelettes d’eau. Une fois sec, scellez le plat avec du Parafilm et placez-le à 4 degrés Celsius. Pour éviter le détachement des cellules des glissements de couverture pendant l’étape de pré-extraction, placez un couvercle recouvert de polylysine dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.
Une fois que les cellules OVCAR3 atteignent 70 à 80% de confluence, aspirez le milieu de la plaque et lavez les cellules avec 5 à 7 millilitres de PBS. Aspirer le PBS de l’assiette. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez 1 millilitre de trypsine à 0,25% et placez le plat dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 8 à 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se décollent du fond de la plaque.
Recueillir les cellules avec 5 à 10 millilitres de milieu et ajouter la suspension cellulaire dans un tube conique. Compter les cellules manuellement avec un hémocytomètre en utilisant les procédures standard. Ensuite, diluez la suspension cellulaire et obtenez un nombre qui donnera une confluence de 70 à 80% après trois populations.
Ajouter 1 millilitre de suspension cellulaire sur des lamelles de couverture de polylysine placées dans les puits d’une plaque de 24 puits, et cultiver les cellules dans le milieu de culture dans des conditions standard. Après un doublement de la population, aspirer les milieux existants de la plaque et pulser les cellules avec 10 micromolaires IdU pour les deux doublements de population suivants. Pour récolter les cellules, remplacez le milieu par du PBSTx glacé à 0,5% sur de la glace pendant cinq minutes.
Pour la fixation des cellules, aspirer PBSTx et incuber les cellules pendant 15 minutes avec 3% de paraformaldéhyde à température ambiante. Après trois à quatre lavages avec du PBS, gardez les cellules fixes à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient utilisées à nouveau. Après la fixation, perméabiliser les cellules en utilisant 0,5% PBSTx sur de la glace pendant cinq minutes, en veillant à couvrir tout le couvercle.
Après avoir lavé les cellules trois à quatre fois avec 1 millilitre de PBST 0,2% à température ambiante, aspirez le PBST et bloquez les échantillons en utilisant 5% BSA fabriqué dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante. Pour l’immunomarquage, préparez une chambre unifiée en mettant une serviette en papier humide sur un Tupperware à fond plat. Couvrir le couvercle de la plaque de 24 puits avec Parafilm.
Placez-le dans la chambre humidifiée et posez les bordereaux de couvercle sur le couvercle de la plaque. Ajouter 60 microlitres d’anticorps primaire de souris anti-BrdU dilué sur le dessus du couvercle. Alternativement, pour réduire le séchage de l’anticorps et utiliser moins de volume, placez une goutte d’anticorps dilué sur le Parafilm et retournez le couvercle dessus.
Puis incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après incubation, aspirer l’anticorps primaire. Retournez le couvercle dans une assiette de 24 puits et lavez-les quatre fois avec 0,2% de PBST.
Ajouter l’anticorps secondaire dilué sur la lamelle de couverture comme démontré précédemment, et incuber pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante. Étiquetez une lame de microscope et montez le couvercle sur les lames avec un support de montage DAPI. Conservez les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 heures si le support de montage doit être durci ou durci.
Les noyaux dérivés des cellules non traitées et traitées avec 0,5 millimolaire d’hydroxyurée ont été colorés et identifiables dans les canaux DAPI et IdU. L’analyse de ces images consiste à quantifier le nombre de foyers dans chaque noyau. Le nombre de foyers est proportionnel au degré de contrainte de réplication.
Il est important de tenir compte du temps de doublement de la lignée cellulaire de choix, car le temps de pulsation de l’IdU peut varier pendant des périodes de doublement plus longues ou plus courtes. Alternativement, nous pouvons sonder les cellules pour la protéine de réplication A pour confirmer les résultats et évaluer diverses réponses au stress de réplication dans les cellules. Cette technique est utilisée pour de nombreuses lignées cellulaires en tandem avec n’importe quel agent induisant des dommages à l’ADN pour examiner l’accumulation d’ADN à contrainte unique.
Ainsi, cette méthode est largement accessible et applicable.
