Le protocole d’essai de cytotoxicité utilisant des lignées cellulaires de poisson zèbre peut répondre à des questions concernant la toxicité aiguë des produits chimiques sur les poissons ou aider à définir les concentrations d’essai appropriées pour d’autres tests alternatifs sur les poissons. Le principal avantage de cet essai sur plaque de 96 puits est la combinaison de différents paramètres de viabilité pour déterminer la cytotoxicité des cellules de poisson zèbre, une espèce de poisson importante dans les études d’écotoxicité. Le protocole est très simple.
Si vous suivez correctement toutes les étapes décrites, vous ne devriez rencontrer aucun problème. Ce protocole permet de réaliser aucune étude d’écotoxicité animale évaluant les effets sur les lignées cellulaires de poissons dérivées de différents organes ou stades de vie tels que les hépatocytes dans les cellules embryonnaires. Pour commencer à plaquer les cellules ZEM2S ou ZFL, calculez le volume des suspensions cellulaires respectives nécessaires pour obtenir le nombre souhaité de cellules pour les essais.
Remplissez un réservoir de réactif stérile avec le milieu de culture complet pour la lignée cellulaire correspondante et transférez le volume calculé de la suspension cellulaire dans le réservoir pour un volume total de 20 millilitres. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélanger doucement la solution de haut en bas sans former de mousse ou de bulles. Ensuite, à l’aide de la micropipette multicanaux, ajoutez 200 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de polystyrène transparent à 96 puits pour obtenir un nombre de cellules viable de 60 000 cellules par puits pour les cellules ZEM2S et de 40 000 cellules par puits pour les cellules ZFL.
Incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour exposer l’un ou l’autre type de cellules à différentes concentrations des produits chimiques d’essai, préparer la concentration souhaitée de solutions chimiques d’essai dans le milieu de culture pour la lignée cellulaire d’intérêt sans sérum fœtal bovin ni FBS. Après l’incubation de 24 heures, jetez soigneusement les milieux usés des puits à l’aide d’une micropipette multicanal.
Ajoutez ensuite 100 microlitres d’une solution chimique d’essai particulière par puits en triplicates techniques, ce qui signifie trois puits pour chaque concentration chimique d’essai. Placer les groupes témoins sur la même plaque que les produits chimiques d’essai en triple exemplaire technique. Pour le contrôle blanc, ajouter 100 microlitres du milieu d’exposition dans trois puits sans cellules.
Pour le témoin négatif, ajouter 100 microlitres du milieu d’exposition à trois puits contenant des cellules. Pour le témoin positif, exposer trois puits contenant des cellules à une solution de Triton X-100 à 1% préparée dans le milieu d’exposition. Scellez les plaques avec un parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour empêcher l’évaporation du milieu de culture et incuber les plaques à 28 degrés Celsius pendant 24 heures.
Après 24 heures d’exposition au produit chimique d’essai, jetez soigneusement le milieu d’exposition des puits en versant le contenu dans un plateau de collecte et lavez chaque puits avec 200 microlitres de PBS. Ensuite, pour retirer le PBS sans perdre de cellules, versez-le soigneusement dans un plateau de collecte. Pour effectuer les tests Alamar Blue ou AB et CFDA-AM, ajoutez 100 microlitres de la solution respective par puits et incuber la plaque pendant 30 minutes dans l’obscurité à 28 degrés Celsius.
Ensuite, mesurez la fluorescence dans un lecteur de plaque de fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées mentionnées dans le texte. Pour effectuer le dosage rouge neutre ou NR, prendre la solution de travail NR ayant une concentration de 40 microgrammes par millilitre et centrifuger à 600 G pendant 10 minutes. Ensuite, retirez soigneusement les solutions AB et CFDA-AM précédemment ajoutées des puits en versant le contenu dans un bac de collecte.
À l’aide d’une micropipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de solution de travail NR par puits et incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant trois heures. Une fois l’incubation terminée, versez soigneusement la solution NR de la plaque dans un plateau de collecte et lavez les puits en ajoutant 150 microlitres de PBS par puits. Après le lavage, ajouter 150 microlitres de la solution d’extraction NR par puits et incuber la plaque en la secouant doucement sur un agitateur à plaques pendant 10 minutes avant de mesurer l’absorbance à 540 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaque.
Pour effectuer le test MTT, après l’exposition chimique de test de 24 heures, retirez soigneusement le milieu d’exposition en versant le contenu dans un plateau de collecte et à l’aide d’une micropipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de solution de travail MTT par puits dans l’obscurité. Incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant quatre heures dans l’obscurité. Ensuite, jetez la solution MTT en versant le contenu dans un plateau de collecte et ajoutez 100 microlitres de DMSO dans chaque puits pour extraire les cristaux de formazan.
Incuber la plaque sur un agitateur à plaques pendant 10 minutes avant de mesurer l’absorption à 517 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques. Pour le test AP, les puits correspondant à des concentrations blanches, témoins positives et hautement cytotoxiques de produits chimiques d’essai ont montré une couleur bleue et une faible fluorescence indiquant soit l’absence ou une réduction des cellules viables. En revanche, les puits correspondant à de faibles concentrations cytotoxiques de la substance d’essai et du témoin négatif contenant un nombre élevé de cellules viables ont converti la résazurine en résorufine rose ayant une fluorescence plus élevée.
Pour le test NR, les concentrations hautement cytotoxiques des produits chimiques d’essai et du contrôle positif sont transparentes ou rose pâle avec une faible absorbance, tandis que les puits contenant des cellules viables conservant le colorant NR présentaient une couleur rose foncé et une absorbance élevée. De même, pour le test MTT, les puits sans cellules viables sont transparents, tandis que ceux contenant des cellules viables transforment le MTT en formazan de couleur violette. Sur la base des pourcentages de viabilité cellulaire calculés, la demi-concentration maximale d’inhibiteur ou la valeur de CI50 a été estimée pour les différents produits chimiques d’essai dans les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S.
Aucune différence significative dans la viabilité cellulaire n’a été observée pour les cultures avec et sans FBS, ce qui indique que les milieux de culture privés de FBS conviennent pour la période d’exposition chimique de 24 heures. Les tests MTT et NR n’ont montré aucun effet significatif de la variation des concentrations de DMSO de 0,1% à 1% sur la viabilité cellulaire, ce qui indique que ces lignées cellulaires soutiennent l’utilisation du DMSO comme solvant jusqu’à 1%Faites particulièrement attention lors de la manipulation des cellules plaquées pour éviter l’auto-détachement pendant toute la procédure et préparez soigneusement la solution de travail rouge neutre pour éviter toute précipitation de colorant. Cette procédure peut être appliquée aux études portant sur plusieurs aspects des effets chimiques sur les poissons à l’aide de modèles in vitro et contribuer à l’avancement d’aucune étude d’écotoxicité sur les animaux.
