Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

L’épithélium pigmentaire rétinien ou EPR est essentiel pour la santé de la rétine. Et l’étude de l’EPR isolé est cruciale pour la maladie de la rétine. Cette méthode d’isolement de l’EPR du cobaye, un modèle populaire de myopie, aide à résoudre le problème difficile.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et donne un échantillon d’EPR de haute qualité adapté aux études moléculaires biologiques, y compris l’analyse RPE. En suivant parfaitement la technique démontrée et en observant comment manipuler les outils de dissection, on peut maîtriser cette procédure rapidement avec un peu de pratique. Après avoir euthanasié sans cruauté le cochon d’Inde et énucléé les yeux de l’animal, lavez immédiatement les yeux en les transférant dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS.

Après le lavage, transférer les yeux dans une solution de PBS fraîche. Maintenant sous un microscope à dissection, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire une petite ouverture initiale dans la sclérotique d’un œil, à environ un millimètre derrière la limite limbique entre la cornée et la sclérotique. À l’aide de ciseaux, retirez le segment antérieur, y compris la cornée, l’iris, le corps ciliaire et le cristallin.

Ensuite, en travaillant avec un segment oculaire postérieur restant, utilisez une pince pour saisir et tirer doucement sur la zonule de Zinn, puis détachez la rétine du complexe EPR / choroïde / sclérotique et décollez la rétine sans fragmentation. Une fois la rétine complètement retirée, immergez le cupule postérieur restant, qui comprend l’EPR, la choroïde et la sclérotique, dans l’un des puits d’une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de réactif de stockage de tissus et maintenez-le immergé pendant cinq minutes. Pour rincer le réactif de stockage, transférez l’œilleton dans un autre puits rempli de quatre millilitres de PBS pendant 10 secondes avant de le déplacer vers un troisième puits rempli de deux millilitres de PBS.

Avant de passer à l’étape finale d’isolement de l’EPR, préparez une seringue d’un millilitre remplie de PBS et fixez une aiguille de calibre 30. Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour créer un flux de PBS. En travaillant sous un microscope, dirigez d’abord ce flux de PBS vers l’EPR pour y faire une petite déchirure ou un trou.

Ensuite, dirigez le flux de PBS dans l’ouverture créée pour détacher le RPE sous forme de feuille de la choroïde. Après avoir détaché l’EPR de la choroïde, recueillir les cellules EPR dans une seringue d’un millilitre sans aiguille et transférer l’échantillon prélevé dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube avec l’EPR recueilli à 8 000 x g pendant une minute pour obtenir une pastille d’EPR.

Pour les échantillons à utiliser dans les analyses d’ARN, jetez le surnageant, c’est-à-dire la solution PBS, et remplacez-le par 350 millilitres de tampon de lyse inclus dans les kits d’isolement d’ARN. Pipeter le contenu de haut en bas 20 fois pour bien mélanger et préserver la qualité de l’échantillon. Pour l’entreposage et la conservation à long terme, transférer les échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Utilisez une trousse d’isolement de l’ARN et suivez les instructions du fabricant pour isoler et prélever l’ARN des échantillons d’EPR avant d’évaluer la qualité de l’échantillon par électrophorèse. Dans notre étude, les échantillons d’EPR collectés ont montré un ARN bien conservé ayant un nombre d’intégrité de l’ARN ou un NIR supérieur à huit. Le nombre total d’ARN est d’environ 240 nanogrammes par œil.

Le niveau d’expression du gène spécifique de l’EPR, Rpe65, s’est avéré significativement plus élevé dans les échantillons d’EPR que dans la choroïde et la sclérotique. En revanche, les échantillons d’EPR ont montré une expression minimale du gène spécifique de la sclérotique choroïde sélectionné, le collagène de type alpha-one, indiquant l’absence de contaminants choroïdiens et scléraux dans les échantillons isolés d’EPR. L’étape la plus importante de la procédure est l’élimination en douceur de la rétine sans laisser de fragment de rétine.

Cette procédure d’isolement de l’EPR justifie une explication des études de culture cellulaire in vitro avec quelques différences importantes, y compris le choix du milieu pour l’immersion des cellules EPR après l’isolement.