Ce protocole décrivait une méthode de dénombrement des cellules tumorales rouges et d’isolement clinique des CTC. Pour commencer, cultivez les cellules tumorales MCF-7, MDA-MB-231 et HeLa dans un flacon de culture cellulaire à une fois 10 à la cinquième dans un millimètre de DMEM, complété par 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Lorsque les lignées cellulaires se développent en monocouches adhérentes jusqu’à 95 % de confluence, détachez-les de la boîte de culture avec une solution de trypsine à 0,25 % pendant deux minutes. Colorez les cellules tumorales en ajoutant trois microlitres de Calcein AM et placez la boîte dans l’incubateur pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, digérez toutes les cellules avec de la trypsine.
Comptez les cellules tumorales de culture dans le PBS avec une chambre de comptage cellulaire et diluez-les jusqu’à ce que 100 cellules tumorales par millilitre de PBS soient obtenues. Ensuite, introduisez la suspension cellulaire diluée dans la puce microfluidique à l’aide d’une seringue munie d’un pousse-seringue à des débits variables. Obtenir l’efficacité de captage pour les différents débits, et déterminer le débit optimal.
Comptez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce et s’écoulant de la sortie. Calculez l’efficacité de capture à l’aide de la formule donnée. Répétez la procédure pour obtenir l’efficacité de capture pour différents nombres de cellules tumorales, de 10 à 100.
Tester et valider la puce microfluidique pour un nombre rare de cellules tumorales. Injectez ces 10 suspensions d’échantillons dans les puces microfluidiques à l’aide d’une aiguille creuse réalisée avec un extracteur de micropipette pour aspirer les cellules tumorales diluées. Détectez et dénombrez le nombre de cellules tumorales pour chaque échantillon après leur capture sur la puce.
Ensuite, colorez les cellules tumorales avec de la calcéine AM et dénombrez 100 cellules tumorales dans cinq microlitres de PBS. Piquez ces cellules dans un millilitre d’échantillon de sang entier normal. Introduisez ces cellules dans la puce et énumérez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce avec l’immunofluorescence verte.
Effectuez le dénombrement in vivo comme décrit et calculez l’efficacité de la capture après la capture. Dénombrer une à 10 cellules tumorales sans coloration. Transformez ces cellules en un millilitre de sang total normal.
Introduisez ces échantillons dans la puce microfluidique et capturez les cellules tumorales. Ajoutez trois à cinq microlitres de colorant fluorescent dans 20 à 30 microlitres de PBS et introduisez cette solution sur la puce à l’aide d’une seringue. Énumérez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce avec une immunofluorescence bleue et verte pour déterminer l’efficacité de la capture.
Ensuite, modifiez la surface de la puce avec 100 microlitres de 4%3-mercaptopropyl triméthoxysilane et de l’éthanol à température ambiante pendant 45 minutes pour la capture basée sur l’affinité de la molécule d’adhésion cellulaire anti-épithéliale. À la fin de l’incubation, lavez la puce trois fois avec de l’éthanol. Ajoutez ensuite 100 microlitres de l’agent de couplage GMBS et laissez-le interagir pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, utilisez une seringue pour laver la puce trois fois avec un millilitre de PBS. Traitez la puce avec 30 à 40 microlitres de neutravidine de 10 microgrammes par millilitre à température ambiante pendant 30 minutes, ce qui entraîne l’immobilisation des cellules sur le GMBS, puis rincez avec du PBS pour éliminer l’excès d’avidine. Modifiez la puce avec trois microlitres d’anticorps anti-molécule d’adhésion des cellules épithéliales anti-biotinylées et incubez-la pendant la nuit.
Toutes les cellules tumorales ont été capturées autour du réseau de la puce d’onde sans qu’aucune cellule ne manque, ce qui indique la grande efficacité de capture de la puce microfluidique. Les cellules tumorales colorées à la Hoechst et à la calcéine AM sont présentées ici. Les CTC d’un patient atteint d’un cancer gastrique capturés à l’aide de micro-filtres en forme de petite ellipse sont présentés ici.
De plus, les CTC d’un patient atteint d’un cancer colorectal capturé à l’aide de micro-filtres trapézoïdaux et émettant à la fois une fluorescence bleue et verte sont présentés. Une efficacité et une viabilité de capture élevées ont été observées pour les cellules tumorales capturées à l’aide de micro-filtres à grandes elliptes. L’analyse clinique par immunofluorescence des CTC colorectaux capturés sur la puce microfluidique a permis de reconnaître les CTC comme étant DAPI-positifs, CK-positifs, CD45-négatifs, et les globules blancs comme DAPI-positifs, CK-négatifs, CD45-positifs.
Les cellules tumorales colorectales cultivées sur la grande puce d’ellipse après capture, et les cellules tumorales colorectales capturées sur les micro-filtres de la grande ellipse sont présentées ici. Cette méthode de modification à l’aide d’un aptamère offre une nouvelle approche pour enrichir l’isolation CTC.
