Comme pour tous les patients atteints de mycoplasmes, leur diagnostic de Mycoplasm pneumoniae est difficile en raison de réactions croisées. Notre ELISA proposé est basé sur la déplétion sélective des antigènes non spécifiques de Mycoplasm pneumoniae à l’aide d’une technique d’adsorption. Le test ELISA interne de capture d’antigènes décrit dans cette vidéo garantit une grande spécificité spacieuse.
Et en fait, il s’est avéré être un test de dépistage fiable pour un diagnostic précis de l’infection à Mycoplasm pneumoniae. Imen Chniba, doctorante, présentera les étapes pré-ELISA. Et les étapes ELISA seront Nadine Khadraoui, une technicienne de notre laboratoire.
Pour commencer la procédure d’adsorption de l’antigène, tirez les 12 antigènes bactériens hétérologues dans un tube de microcentrifugation et ajustez la concentration en protéines correspondant à la moitié de l’antisérum à adsorber. Ensuite, centrifuger le mélange d’antigènes à 14 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir la pastille. Ensuite, remettez la pastille en suspension avec les IgG polyclonales anti-Mycoplasma pneumoniae purifiées et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec une agitation lente.
A la fin de l’incubation, centrifuger à nouveau la suspension à 14 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et récupérer le surnageant correspondant à l’antisérum polyclonal spécifique Mycoplasma pneumoniae. Pour enduire une plaque ELISA de 96 puits d’un anticorps de capture, diluez l’anticorps à 10 microgrammes par millilitre et 0,1 tampon de bicarbonate molaire à pH 9,6. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de l’anticorps dilué à chaque puits de la microplaque et incuber pendant une nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, retirez la solution de revêtement et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage. Ensuite, bloquez les surfaces non liées des puits revêtus en ajoutant 100 microlitres de la solution de blocage à chaque puits. Après avoir incubé la plaque pendant une heure à température ambiante, retirez la solution de blocage à l’aide d’une pipette et lavez la plaque comme indiqué précédemment.
Ajouter une quantité égale de protéines entières de Mycoplasma pneumoniae à une concentration de 10 nanogrammes par puits et laisser la réaction antigène-anticorps se produire pendant deux heures à température ambiante. Après l’incubation, retirer l’excès d’antigène et laver la plaque comme indiqué. Ensuite, diluez les échantillons de test de sérum humain et faites référence aux témoins séropositifs et négatifs.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres des échantillons d’essai dilués et des témoins dans les puits et les doublons appropriés. Marquez les puits ne contenant ni antigène ni sérum comme étant vides. Après avoir incubé la plaque pendant 90 minutes à température ambiante, retirez la solution de sérum et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
Pipeter 100 microlitres des anticorps de détection conjugués enzymatiques dilués appropriés à chaque puits et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Après avoir retiré les corps de détection non liés et lavé la plaque, ajoutez 100 microlitres de solution de chromogène TMB pour visualiser la liaison antigène-anticorps. Laissez la plaque se développer pendant 30 minutes à température ambiante.
Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres d’acide sulfurique à 7,5%. Enfin, lisez l’absorbance à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques et triez les résultats en fonction du calcul de l’indice de positivité. L’analyse par immunotransfert entre l’antisérum polyclonal non adsorbé de Mycoplasma pneumoniae et les antigènes bactériens hétérologues a révélé une réactivité croisée mais d’intensité variable.
Par exemple, les antigènes de Mycoplasma gallisepticum et de Mycoplasma imitans ont montré la plus forte réactivité bien qu’il s’agisse de mycoplasmes aviaires. En revanche, aucun des deux isolats cliniques humains d’Ureaplasma urealyticum n’a montré de réaction. Cependant, les antigènes des espèces de mycoplasmes génitaux humains restants et d’autres antigènes bactériens ont produit des réactions croisées considérables avec l’antisérum.
L’analyse par immunotransfert a confirmé l’efficacité de l’adsorption polyclonale de l’antisérum Mycoplasma pneumoniae contre les antigènes bactériens hétérologues. La procédure d’adsorption a éliminé toutes les réactions croisées, rendant ainsi l’antisérum Mycoplasma pneumoniae spécifique pour tous les tests sérologiques et immunoblotting ultérieurs. De plus, l’ensemble de sérums humains testés à l’aide du test ELISA de capture d’antigènes développé dans cette étude s’est avéré positif pour les IgG de Mycoplasma pneumoniae avec une bonne spécificité.
La spécificité de cet ELISA est principalement assurée par la technique d’adsorption, car il est primordial d’effectuer cette étape critique avec soin et de la répéter au moins deux ou trois fois. Le principe de cette technique peut être appliqué pour diagnostiquer d’autres espèces de mycoplasmes ou d’autres bactéries en général. Cependant, la sélection des antigènes bactériens pour l’adsorption ne doit pas être pertinente et adéquate.
