Les microorganismes formant des biofilms sont un problème majeur dans l’industrie alimentaire, y compris l’industrie laitière. En raison de leur impact négatif sur la qualité des produits, il est important de développer des stratégies de contrôle du biofilm. Cette approche combine une méthode de criblage statique à haut débit et une méthode dynamique qui imite les conditions in situ.
Ces deux méthodes sont complémentaires pour étudier l’efficacité des désinfectants contre les biofilms. Cette approche peut être utilisée pour tester de nouvelles formulations biologiques ou chimiques pour contrôler les biofilms dans les secteurs alimentaire, médical ou environnemental. Commencez par vortex des tubes de culture bactérienne de Pseudomonas azotoformans.
Transférer de manière aseptique 100 microlitres de la culture bactérienne dans 10 millilitres de bouillon de soja tryptique stérile ou de milieu BST pour atteindre la concentration finale d’environ deux fois 10 à la septième UFC par millilitre. Vortex le tube de culture. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 microlitres de la culture bactérienne diluée dans les puits de plaque de microtitrage du biofilm en trois exemplaires.
Charger 150 microlitres de milieu BST dans trois nouveaux puits comme témoin. Ensuite, incuber la plaque de microtitrage du biofilm à 30 degrés Celsius pendant 24 heures sans agitation. Nettoyez et séchez à l’air libre les parties du bioréacteur avant de placer la lame plate à l’intérieur du bécher en verre d’un litre fixé au support par une barre magnétique.
Maintenez la configuration verticale à l’aide de la barre de plastique fixée à la face interne du couvercle du bioréacteur. Utilisez le tournevis pour placer les coupons ou les glissières en acier inoxydable sur leurs tiges en polypropylène. Insérez des coupons ou des glissières dans les trous du couvercle sans placer leurs goupilles d’alignement dans les encoches permettant à la vapeur de s’échapper pendant la stérilisation.
Couvrir tous les évents du bioréacteur avec une feuille d’aluminium et envelopper le reste de l’équipement, à savoir le tube de taille 18 et le tube de taille 16, le frein à flux en verre, les bouchons de conteneur, les tournevis, les pinces et les filtres de 0,2 micromètre avec une feuille d’aluminium. Autoclave du bioréacteur mis en place dans un cycle sec à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour effectuer la première étape de la formation du biofilm dans le bioréacteur en mode batch, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, connectez une extrémité du tube de taille 18 au bec de sortie du bioréacteur et gardez l’autre extrémité enveloppée dans du papier d’aluminium.
Retirez un porte-coupon ou une glissière du couvercle du bioréacteur et placez-le dans un tube stérile de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 50 millilitres, remplissez le bécher du bioréacteur avec 340 millilitres de 300 milligrammes par millilitre de milieu TSB à travers le trou occupé par la tige. Pour inoculer le milieu de culture dans le bioréacteur, ajouter un millilitre de 10 à la huitième solution bactérienne de Pseudomonas azotoformans par millilitre à travers l’orifice à l’aide d’une pipette de cinq millilitres et remettre la tige dans sa position d’origine.
Positionnez les tiges déjà placées dans les trous du couvercle pour que les broches s’insèrent dans les encoches respectives. Placez ensuite un filtre bactérien de purge d’air de 0,2 micromètre à l’extrémité du tube de plus petit diamètre situé sur le couvercle du bioréacteur. L’autre tube du même diamètre reste bouché en permanence avec un bouchon à vis métallique ou un bouchon en silicone qui se ferme hermétiquement.
Placez le bioréacteur pendant 24 heures sur la plaque chauffante réglée à 30 degrés Celsius et agitez à 130 tr / min. Après 24 heures, effectuer la deuxième étape de la formation du biofilm dans le bioréacteur en mode flux continu. Placez une bonbonne contenant 18 litres d’eau distillée stérile dans l’armoire de biosécurité.
Ajoutez ensuite deux litres de 1000 milligrammes par litre de milieu de culture TSB pour obtenir une concentration finale de 100 milligrammes par litre. Couvrir le récipient avec son bouchon stérile auquel deux tubes sont connectés. Le premier est un tube en silicone fixé sur l’interface du bouchon pour pomper le milieu.
Le second tube de taille 16 est relié au port externe permettant au liquide de s’écouler vers le bioréacteur. Après avoir raccordé le tube de taille 16 à l’extrémité du frein d’écoulement en verre, insérez ce dernier dans le plus grand tube du couvercle du bioréacteur par son autre extrémité puis installez le tube de taille 16 dans la pompe péristaltique. Utilisez une autre bonbonne de 20 litres pour recueillir les effluents du bioréacteur.
Fixez l’extrémité du tube relié au bec de sortie du bioréacteur au bouchon du conteneur à déchets. Insérez un filtre de 0,2 micromètre dans le tube présent sur le couvercle de ce récipient. Une fois cela fait, démarrez la pompe péristaltique à un débit de 11,3 millilitres par minute et laissez le système fonctionner pendant 24 heures.
Après 24 heures, éteignez la pompe péristaltique et arrêtez d’agiter et de chauffer le bioréacteur. Pour récupérer le biofilm bactérien, rincez les coupons ou les lames dans 40 millilitres de PBS pour éliminer les bactéries planctoniques. Ensuite, relâchez-les dans un tube conique stérile de 50 millilitres contenant 40 millilitres de PBS.
Après 30 secondes de vortex, soniquer les tubes à 40 kilohertz pendant 30 secondes. Répétez cette opération trois fois. Une fois cela fait, recueillir les 40 millilitres de suspension de biofilm dans un tube conique stérile de 50 millilitres et rincer les coupons ou les lames avec deux de solution PBS stérile.
Récupérez ce liquide de rinçage et ajoutez-le à la suspension de biofilm déjà recueillie. Retirez la plaque de microtitrage de 30 degrés Celsius. Ajoutez 200 microlitres de PBS dans trois puits d’une microplaque de 96 puits.
Pour laver les biofilms et éliminer les bactéries planctoniques, transférez le couvercle de la microplaque de biofilm avec les biofilms formés sur les chevilles à la microplaque à 96 puits contenant le PBS pendant 10 secondes. Préparer les désinfectants aux concentrations requises et ajouter 200 microlitres de chaque concentration de désinfectant dans les puits d’une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits en trois exemplaires. Transférer le couvercle de la plaque de microtitrage de biofilm sur la plaque de microtitrage à 96 puits contenant les désinfectants et incuber la plaque à température ambiante pendant la durée d’exposition souhaitée.
Ensuite, ajoutez 200 microlitres de bouillon neutralisant Dey-Engley aux puits d’une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits. Transférer le couvercle de la plaque de microtitrage de biofilm sur la plaque de microtitrage à 96 puits contenant le bouillon neutralisant. Scellez la plaque de microtitrage avec un parafilm et placez-la dans le sonicateur de bain à 40 kilohertz pendant 30 minutes.
Après 30 minutes, à partir de la première colonne de la plaque soniquée, transférer 100 microlitres de biofilms détachés sur la première rangée d’une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits. Ajoutez ensuite 180 microlitres de PBS stérile à une plaque de 96 puits, à l’exception de la première rangée. Ensuite, transférez 20 microlitres de la solution de biofilm de la première rangée aux puits de la deuxième rangée contenant 180 microlitres de PBS pour obtenir la dilution de 10 à moins un.
Ensuite, transférez 20 microlitres de la deuxième rangée vers les puits de la rangée suivante pour obtenir la dilution de 10 à moins deux. Répéter cette opération pour obtenir une dilution comprise entre 10 à moins cinq et 10 à moins sept. Inoculer 100 microlitres de la dilution souhaitée sur TSA et incuber les plaques selon les paramètres de croissance de la bactérie.
Former les biofilms PFLA 1 de Pseudomonas azotoformans sur les coupons dans le bioréacteur, retirer la tige contenant les coupons et rincer la tige à l’intérieur d’un tube conique contenant 30 millilitres de PBS pour éliminer les cellules planctoniques. Déposez chaque coupon dans un tube conique stérile de 50 millilitres à l’aide d’un tournevis. Ajoutez ensuite quatre millilitres de la solution de peroxyacide organique appropriée ou du PBS pour le contrôle.
Après cinq minutes d’incubation, ajoutez 36 millilitres de bouillon neutralisant Dey-Engley. Après avoir fait tournoyer le tube conique pendant 30 secondes, sonicez-les à 40 kilohertz pendant 30 secondes. Répétez le processus trois fois pour obtenir la suspension de biofilm.
Répétez la même procédure avec les autres tiges, préparez des illusions en série de la suspension de biofilm et plaquez la suspension sur un milieu TSA comme décrit précédemment. L’analyse SCM a montré la présence du biofilm par Pseudomonas azotoformans PFL1A sur les chevilles de microplaques du biofilm. Le biofilm de Pseudomonas azotoformans PFL1A formé sur une lame en acier inoxydable à l’aide d’un bioréacteur semblait très dense et présentait les caractéristiques morphologiques d’un biofilm tridimensionnel mature.
Les résultats des numérations bactériennes des biofilms développés par cet isolat dans le système dynamique ont montré des densités cellulaires significatives correspondant à 8,74 log UFC par centimètre carré dans le milieu de culture du BST et à 7,86 log CFU centimètre carré dans le lait écrémé stérile. Les résultats obtenus avec l’isolat de B. vesicularis ont montré que l’augmentation de la concentration en nutriments de 100 à 900 milligrammes par litre entraînait une augmentation du nombre de bactéries des biofilms de 6,11 à 8,71 log CFU centimètre carré. De plus, une croissance significative du biofilm a été observée lorsque le débit a été réduit à 6,0 millilitres par minute, ce qui indique que certains facteurs pourraient influencer la formation de biofilm dans le bioréacteur.
Aucun des biofilms ne contenait de cellules viables détectables à un temps de contact de cinq minutes dans 500 parties par million avec des peroxyacides organiques et 100 000 parties par million avec des concentrations de peroxyde d’hydrogène de désinfectants habituellement appliqués dans les usines laitières. Le SCM a montré la structure tridimensionnelle de la concentration minimale d’éradication du biofilm non traitée ou des biofilms MBEC, tandis que les biofilms MBEC traités ont perdu leur conformation tridimensionnelle. Il est essentiel de rester à l’état stérile pendant l’exécution de ce protocole.
En outre, l’utilisateur doit se rappeler que les résultats générés sont associés à un isolat et à un désinfectant uniques. La combinaison de désinfectant avec des vibrations mécaniques, des ultrasons ou des traitements enzymatiques pourrait être évaluée pour améliorer l’efficacité de l’éradication du biofilm. Cette approche utilisant des méthodes statiques et dynamiques pour former des biofilms a ouvert la voie aux chercheurs pour cribler et étudier de nouvelles formulations d’antibiofilms afin de mieux contrôler les biofilms dans divers secteurs.
