Ce protocole est utile dans de nombreuses études biologiques et toxicologiques sur les abeilles mellifères traitées avec des pesticides. Il aide à détecter les réponses cellulaires des tissus d’abeilles mellifères des acaricides qui sont utilisés dans les colonies d’abeilles pour le traitement contre les acariens Varroa. C’est un outil puissant pour la détection de sous-petits effets sur les tissus en combinaison avec le comportement des abeilles ou d’autres insectes utiles.
Pour commencer, prenez soigneusement une abeille ouvrière avec une pince et mettez-la sur de la glace ou un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant deux minutes pour l’immobiliser. Épinglez l’abeille sur la boîte de Petri en diagonale à travers la partie postérieure supérieure du thorax deux fois de gauche à droite et de droite à gauche. Pauvre insecte salin pour couvrir le corps.
Placez la boîte de Petri sous le stéréomicroscope, faites la mise au point et ajustez. Pour disséquer l’intestin moyen, commencez par l’abdomen en insérant un point des ciseaux sous le tergite A5 au centre du côté droit du corps de l’abeille. Couper au tergite A2. Gardez la lame interne des ciseaux parallèle au côté du corps pour éviter d’endommager les organes internes.
Tournez les ciseaux vers la gauche et coupez. Ouvrez doucement la partie gauche de l’abdomen et épinglez-la. À l’aide d’une pince, tirez doucement l’estomac de l’abeille vers le haut et, avec des ciseaux dans l’autre main, coupez à la toute extrémité de l’œsophage.
Retirez l’estomac et l’intestin moyen de l’abdomen et coupez le rectum. Utilisez une pipette avec une solution saline d’insectes et retirez les matières fécales ou les parties du tissu. Pour la dissection des glandes hypopharyngées, immobiliser une abeille ouvrière sur la glace comme décrit précédemment.
Coupez la tête et placez-la sur une plaque plus petite avec l’antenne tournée vers le haut. Fixez la tête avec deux épingles, l’une à travers l’œil composé gauche et la seconde à travers l’œil composé droit. Faites une coupe à travers le premier œil composé sur le côté interne des épingles, continuez jusqu’au labrum, puis faites une autre coupe de l’autre côté à travers le deuxième œil composé.
Coupez les antennes. Soulevez le masque et coupez là où il est encore attaché. Prenez les forceps et retirez soigneusement les glandes ainsi que le cerveau et une partie des yeux composés.
Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, mettez les sections déparaffinées et réhydratées dans de l’hématoxyline pendant cinq minutes. Ensuite, placez-les soigneusement sous l’eau courante du robinet pendant deux minutes. Ensuite, mettez-les dans de l’eau distillée pendant une minute et de l’éosine pendant quatre minutes.
Placez les lames d’éthanol à 96% pendant une minute, puis le 2-propanol pendant deux minutes, et enfin dans l’agent de compensation pendant deux minutes. Ajoutez un support de montage et un verre de couverture et laissez-les sécher. Observez au microscope optique.
Préparez les pots Colin. Préparer la protéinase-K. Après avoir déciré et réhydraté les sections, placez les lames dans PBS pendant cinq minutes.
Placez les lames à plat dans le récipient et ajoutez la protéinase-K. Lavez les lames à l’eau distillée. Tremper dans la peroxydase endogène à température ambiante.
Rincez les lames avec du PBS ou de l’eau. Placez les lames à plat dans le récipient et appliquez un tampon d’équilibrage pendant 10 secondes à température ambiante. Après avoir essuyé le tissu, ajoutez l’enzyme désoxynucléotidyltransférase terminale à chaque section et incuber dans une chambre humidifiée pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Avant l’incubation, placez des serviettes en papier humidifiées à l’intérieur du plateau autour des lames et recouvrez-les d’une pellicule de plastique. Après l’incubation, placez les échantillons sur la grille et laissez-les dans un tampon de lavage d’arrêt. Après avoir lavé les lames dans du PBS et essuyé les tissus, ajouter deux gouttes de conjugué anti-digoxigénine peroxydase chaud aux sections et incuber pendant 30 minutes dans un récipient humidifié.
Après le lavage au PBS, préparer le substrat de peroxydase de résistance au travail, couvrir les sections avec le substrat de peroxydase et colorer pendant cinq minutes. Placez la lame sous le microscope et déterminez le temps de coloration optimal. Après avoir lavé les lames dans une grille de coloration et de l’eau distillée, incuber les lames dans de l’eau distillée pendant cinq minutes.
Contre-coloration à l’aide d’hématoxyline pendant deux minutes. Lavez les lames en les plaçant sous l’eau courante du robinet pendant trois minutes, puis dans de l’eau distillée. Montez les glissières sous les lames de couvercle en verre et le support de montage et laissez sécher à plat.
Observez au microscope optique. Le pourcentage de cellules affectées a été calculé à l’aide d’un microscope optique. Les résultats ont indiqué que le traitement à l’acide oxalique affectait de manière significative les cellules de l’intestin moyen.
L’immunomarquage a montré des produits de réaction rouges ou bruns positifs dans les noyaux apoptotiques des glandes hypopharyngées. Le produit de réaction positive après un traitement par imidaclopride ou coumaphos a été déterminé dans la majorité des cellules glandulaires. Lors du soulèvement du masque de la tête d’abeille, veillez à ne pas endommager ou arracher les parties des glandes hypopharyngées.
Cette technique détecte les changements subcliniques chez les abeilles et convient également à la détection d’autres effets environnementaux sur les abeilles et certains autres organismes vivants.
