Notre protocole offre une avancée significative dans la synthèse de nanogels chargés de protéines inférieures à 100 nanomètres dans une technique de réticulation et de co-polymérisation en une seule étape dans des conditions de réaction aqueuses douces. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à synthétiser des nanogels chargés de protéines dans des conditions douces, en évitant les solvants organiques agressifs et les températures élevées, préservant ainsi l’intégrité de la charge utile biologique. Commencez par laver la verrerie avec de l’eau déminéralisée filtrée.
Pour sécher la verrerie, fixez une buse sécurisée à la sortie d’air comprimé située sur le côté de la hotte. Tenez fermement le flacon, positionnez la buse à l’intérieur et activez l’air comprimé pour émettre un jet contrôlé. Ensuite, remplissez un flacon en verre de 10 millilitres d’eau désionisée et scellez-le avec un septum en caoutchouc.
Pour désoxygéner l’eau, remplissez un ballon d’azote gazeux et fixez une aiguille au ballon. Placez-le sur le septum et percez le septum en caoutchouc pour permettre à l’azote de s’écouler. Fixez également une aiguille de sortie au ballon pour maintenir un flux d’azote constant.
Ensuite, dissolvez le BSA marqué BSA ou Cy7 dans de l’eau déminéralisée désoxygénée. Ajoutez ensuite cette solution dans un flacon en verre propre de 10 millilitres. Ajoutez la solution AETC dans le ballon et scellez-le avec un autre septum en caoutchouc.
Dissoudre l’acrylamide et l’eau déminéralisée désoxygénée et ajouter cette solution au mélange du flacon. Dissoudre ensuite le réticulant disulfure dans de l’eau désionisée et l’ajouter au mélange dans le flacon. Rincez le mélange avec de l’azote gazeux pendant 20 minutes.
Ensuite, dissoudre le SDS dans de l’eau déminéralisée désoxygénée. À l’aide d’une seringue rincée à l’azote, introduisez-le dans le mélange. Ensuite, ajoutez TEMED au mélange réactionnel.
Laissez le mélange se désoxygéner pendant trois minutes sous un flux continu d’azote gazeux. Dissoudre le persulfate d’ammonium dans un millilitre d’eau déminéralisée désoxygénée et l’introduire dans le mélange réactionnel. Fermez ensuite le ballon sous une atmosphère d’azote et remuez le mélange pendant trois heures et 30 minutes à température ambiante.
Pour terminer la réaction, retirez le sceau de la fiole. La réaction se termine lorsque le mélange devient clair et incolore. Pour purifier les nanogels, ajoutez le mélange réactionnel dans une unité de filtration centrifuge de 15 millilitres.
Remplissez l’unité d’eau déminéralisée et centrifugez-la pour éliminer les produits chimiques non réactifs ou la charge utile non encapsulée. Ajoutez deux millilitres d’eau déminéralisée dans l’unité centrifuge pour diluer l’échantillon de nanogel. Conservez l’échantillon final entre deux et huit degrés Celsius pour éviter la dégradation de la protéine encapsulée.
Munissez-vous d’une cuvette ou d’une cellule capillaire pliée jetable pour analyse. Nettoyez-le avec un filtre à eau déminéralisée, puis soufflez de l’air comprimé pour éliminer les grosses particules de poussière. Remplissez ensuite la cuvette avec 50 à 100 microlitres de l’échantillon, en le diluant avec 750 à 1 000 microlitres d’eau déminéralisée filtrée.
Pour insérer la cuvette dans l’instrument DLS, ouvrez le couvercle du compartiment à échantillons et tenez la cuvette par ses bords supérieurs pour éviter de laisser des empreintes digitales sur les fenêtres optiques. Placez la cuvette correctement alignée avec le chemin optique de l’instrument. Fermez ensuite le compartiment à échantillons pour bloquer la lumière ambiante.
Lancez la mesure de la taille des particules à l’aide du logiciel approprié sur la machine DLS. Après la mesure, sélectionnez les résultats pertinents pour l’échantillon, y compris la moyenne Z, l’IP moyen, le taux de comptage par minute, le potentiel zêta et les graphiques associés. Vérifiez que la fonction de corrélation affiche une courbe sigmoïdale lisse indiquant un échantillon uniforme.
Une fois l’analyse terminée, retirez soigneusement la cuvette de l’instrument DLS. Une diminution progressive de l’intensité du pic associé à la protéine BSA a été observée, suggérant l’encapsulation de la protéine dans la structure du nanogel. La caractérisation physico-chimique des nanogels chargés de BSA marqués Cy7 a montré un seul pic défini à 50 à 100 nanomètres.
Cependant, les nanogels vides ont montré des tailles incohérentes et plus grandes. Jusqu’à 86 % des BSA encapsulés marqués Cy7 ont été libérés dans les 48 heures. D’autre part, des expériences de contrôle sans glutathion ajouté n’ont conduit qu’à la libération de 15 % de protéines.
L’analyse infrarouge à transformée de Fourier a montré que la BSA isolée lors de la synthèse du nanogel et de l’incubation post-glutathion conservait sa structure, indiquée par le pic à 1 662 centimètres inverse représentant des tours bêta intacts. Cependant, la BSA des nanogels stockés pendant 30 jours a montré un pic à 1 613 centimètres en sens inverse, ce qui indique des structures intermoléculaires de feuillets bêta et une agrégation de protéines. Le dichroïsme circulaire a montré des spectres inaltérés comme la BSA native, indiquant une structure hélicoïdale alpha préservée.
Cependant, des aberrations mineures dans les pics caractéristiques de la BSA isolée après 30 jours ont suggéré une certaine agrégation. Le maintien d’un flux continu d’azote est essentiel pour empêcher l’oxygène d’inhiber la polymérisation par radicaux libres. De plus, les composants du système d’amorçage nécessitent un ajout rapide pour une synthèse réussie.
Après cette procédure, la distribution de la taille d’un nanogel, la morphologie et la cinétique de libération de la charge utile peuvent être caractérisées davantage par DLS, TEM et évaluation de la réactivité redox par incubation avec l’agent réducteur physiologique glutathion.
