Notre protocole établit une distinction entre les zones riches en collagène et les zones manquantes de collagène dans les sections du foie. Il peut ainsi être utilisé pour étudier les processus de fibrogenèse dans les moindres détails. Le principal avantage de la technique réside dans l’utilisation de la microscopie polarisante pour localiser les zones riches en collagène dans les sections du foie.
Nos protocoles peuvent fournir un excellent aperçu du développement de la fibrose hépatique, et ils peuvent également être adoptés pour d’autres tissus mous tels que les poumons après certaines optimisations. Pour commencer, retirez les sections de foie congelées à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les à température ambiante pendant deux minutes. Fixez les sections avec du paraformaldéhyde glacé à 4% dans du PBS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez cinq fois avec du PBS.
Après le dernier lavage, essuyez l’excès de PBS autour de la section du foie à l’aide de tissu et marquez une limite d’environ deux centimètres sur quatre autour de la section du foie avec un stylo marqueur hydrophobe. Couvrez l’échantillon avec du PBS, puis chargez l’échantillon sur la scène AFM et couvrez-le avec la tête AFM. Dans le logiciel de microscopie à force atomique ou AFM, accédez à l’onglet Configuration et cochez l’enregistrement automatique pour enregistrer automatiquement tous les fichiers.
Spécifiez ensuite le nom du fichier et le répertoire pour enregistrer les fichiers de mesure en allant dans l’onglet de configuration et en cliquant sur enregistrer les paramètres. Approchez la surface du tissu avec le porte-à-faux AFM en allumant le laser et en cliquant sur la touche d’approche. Une fois l’approche terminée, retirez la pointe du porte-à-faux en cliquant une fois sur la touche de rétraction, ce qui rétracte le porte-à-faux à l’extrémité supérieure de la plage piézoélectrique.
Si nécessaire, réalignez le détecteur à l’aide des boutons de la tête AFM. Éteignez le laser. La pointe est maintenant au centre de l’objectif.
Ensuite, superposez le champ optique du microscope avec les cartes de mesure AFM en cliquant sur l’onglet accessoires et en sélectionnant l’étalonnage optique par superposition directe. Dans la fenêtre suivante, cliquez sur Suivant pour prendre une série d’images du porte-à-faux scannant une zone spécifique. Cliquez à nouveau sur Suivant pour passer à la fenêtre suivante.
Dans la première image, cliquez manuellement sur le centre de la pointe du porte-à-faux pour représenter la position de la pointe dans le logiciel. Le cercle représentant la position de la pointe peut être manipulé en taille en indiquant son rayon pour augmenter la précision. Cliquez sur Calibrer pour détecter automatiquement la position de la pointe en porte-à-faux dans toutes les images.
Confirmez l’exactitude de la détection des pointes en parcourant les images. Cliquez sur Suivant, puis sur Terminer pour terminer la superposition optique. Ensuite, déplacez la scène pour positionner une zone riche en collagène à l’intérieur de la boîte verte, visible dans l’onglet de la visionneuse de données, à l’aide de l’image polarisée.
Sélectionnez la zone riche en collagène en définissant la zone sous l’onglet grille, puis créez un rectangle sur l’onglet de la visionneuse de données en appuyant longuement sur le bouton gauche de la souris dans la zone verte spécifiée. Cliquez sur confirmer la nouvelle région de numérisation pour définir la zone sélectionnée comme zone de mesure. Définissez les paramètres de la boucle de rétroaction.
Set I gagne à 50 hertz et P gain à 0,001. Ensuite, définissez le point de consigne à un nano Newton. Sélectionnez la valeur de consigne relative en fonction des propriétés mécaniques des matériaux étudiés et de la rigidité du porte-à-faux.
Spécifiez une ligne de base juste pour ajuster correctement les courbes de force. Sélectionnez ensuite la longueur du mouvement en porte-à-faux sur l’axe Z en fonction de la topographie de surface de l’échantillon. Réglez le mouvement Z sur une durée constante.
Définissez le temps d’extension sur une seconde avec les délais d’extension et de rétractation à zéro. Réglez la fréquence d’échantillonnage à 5 000 hertz. Marquez une coche devant la boucle fermée Z pour ajuster automatiquement la distance entre l’échantillon et la pointe en porte-à-faux pendant les mesures.
Débrayez ensuite la commande de scène motorisée en désélectionnant le bouton d’engagement. Allumez le laser et approchez l’échantillon avec le porte-à-faux. Cliquez sur démarrer l’analyse pour collecter les courbes de distance de force.
Analysez les données acquises à l’aide du logiciel open source AtomicJ. Chargez les courbes de force dans le programme en cliquant sur l’icône des courbes de force de processus et des cartes. Puis dans l’assistant de traitement, ajoutez les cartes à analyser en cliquant sur le bouton ajouter.
Une fois les cartes chargées, cliquez sur Suivant. Spécifiez les paramètres de traitement dans la fenêtre suivante. Pour estimer automatiquement le point de contact entre l’échantillon et le porte-à-faux à l’aide d’un ensemble de paramètres de courbe d’ajustement, utilisez l’estimation automatique du point de contact.
Déterminer le point de contact entre le porte-à-faux et l’échantillon par la méthode classique de la grille focalisée. Sélectionnez la méthode d’estimation comme méthode indépendante du modèle pour obtenir la meilleure détermination du point de contact en fonction de la qualité des courbes de force mesurées, qui doit être déterminée empiriquement lors de l’optimisation de l’analyse des données. Ajustez la courbe d’indentation de force en utilisant un modèle classique comme L deux classique pour l’ajustement du modèle.
Définissez l’ajustement du modèle à la courbe de retrait. Réglez le ratio de Poisson à 0,45 comme recommandé pour les tissus mous tels que le foie. Réglez l’ajustement de la courbe en utilisant un degré de base de trois et un degré de contact de un.
Modifiez le degré d’ajustement du polynôme en fonction de l’échelle des écarts des courbes par rapport au modèle. Sélectionnez le modèle utilisé pour ajuster les courbes de retrait comme modèle de Sneddon. Remplissez le rayon de la pointe sphérique à 2,9 micromètres.
Chargez la constante de ressort et invOLS à partir des fichiers de données en activant la lecture, puis cliquez sur terminer. Après l’analyse des données, parcourez les courbes de force. Exclure les courbes de force où le porte-à-faux s’est approché de manière incorrecte de la surface de la section du foie.
Ces courbes ont un bruit élevé et des formes aberrantes. Après cela, les données peuvent être copiées ou exportées. Dans cette étude, des coupes hépatiques légèrement fixées obtenues à partir de souris témoins et de souris atteintes de fibrose légère et avancée induite par l’injection de tétrachlorure de carbone ont été sondées avec AFM.
Les zones proches des veines centrales correspondant aux zones où les fibres de collagène chez les souris tétrachlorure de carbone se forment habituellement ont été analysées dans les foies témoins. La distribution des modules de Young était reproductible dans différentes régions dans les foies témoins et les zones riches en collagène au sein d’une seule section hépatique. Chez les souris traitées au tétrachlorure de carbone, les cartes de rigidité correspondant aux zones péricentrales des dépôts de collagène ont montré des valeurs significativement plus élevées des modules de Young par rapport aux zones équivalentes chez les souris témoins.
De plus, il y avait une augmentation significative des valeurs des modules de Young avec un traitement plus long. L’effet du stockage prolongé de sections de foie sur les propriétés mécaniques des fibres de collagène a également été évalué. Les mesures AFM ont montré des valeurs significativement plus faibles des modules de Young dans les zones riches en collagène pour les sections stockées pendant trois mois, par rapport à celles obtenues dans les deux semaines.
Le moment de la fixation de la section du foie détermine grandement les propriétés mécaniques de la section du foie. Nous recommandons que les intervalles chronométrés indiqués dans le protocole soient strictement suivis. Après certaines optimisations dans le protocole, la méthode donnée peut être utilisée pour tous les tissus mous présentant un dépôt de collagène significatif, détectable par microscopie polarisante.
La technique donnée fournit aux chercheurs un protocole unifié et pratique pour étudier le mécanisme du foie à travers la santé et la maladie.
