Unser Protokoll unterscheidet zwischen kollagenreichen und kollagenarmen Bereichen in den Leberabschnitten. Es kann somit verwendet werden, um die Prozesse der Fibrogenese genauer zu untersuchen. Der Hauptvorteil der Technik liegt in der Verwendung der Polarisationsmikroskopie, um kollagenreiche Bereiche in den Leberabschnitten zu lokalisieren.
Unsere Protokolle können einen guten Einblick in die Entwicklung von Leberfibrose geben, und es kann auch für andere Weichteile wie Lungen nach bestimmten Optimierungen übernommen werden. Entfernen Sie zunächst die gefrorenen Leberabschnitte von minus 80 Grad Celsius und tauen Sie sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Fixieren Sie die Abschnitte mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, gefolgt von fünfmaligem Waschen mit PBS.
Wischen Sie nach dem letzten Waschen das überschüssige PBS mit Gewebe um den Leberabschnitt herum ab und markieren Sie mit einem hydrophoben Markerstift eine Grenze von etwa zwei mal vier Zentimetern um den Leberabschnitt. Decken Sie die Probe mit PBS ab, laden Sie sie dann auf den AFM-Tisch und decken Sie sie mit dem AFM-Kopf ab. Gehen Sie in der Rasterkraftmikroskopie- oder AFM-Software zur Registerkarte Setup und aktivieren Sie ein Häkchen bei AutoSave, um alle Dateien automatisch zu speichern.
Geben Sie dann den Dateinamen und das Verzeichnis zum Speichern der Messdateien an, indem Sie auf die Registerkarte Einstellungen klicken und auf Einstellungen speichern klicken. Nähern Sie sich der Gewebeoberfläche mit dem AFM-Cantilever, indem Sie den Laser einschalten und auf die Annäherungstaste klicken. Nachdem der Anflug abgeschlossen ist, ziehen Sie die Auslegerspitze ein, indem Sie einmal auf die Rückzugstaste klicken, wodurch der Ausleger bis zum oberen Ende des Piezobereichs zurückgezogen wird.
Richten Sie den Detektor bei Bedarf mit Drehknöpfen am AFM-Kopf neu aus. Schalten Sie den Laser aus. Der Tipp steht nun im Fokus des Ziels.
Als nächstes überlagern Sie das optische Feld des Mikroskops mit AFM-Messkarten, indem Sie auf die Registerkarte Zubehör klicken und die direkte optische Overlay-Kalibrierung auswählen. Klicken Sie im folgenden Fenster auf Weiter, um eine Reihe von Bildern des Auslegers aufzunehmen, der einen bestimmten Bereich scannt. Klicken Sie erneut auf Weiter, um zum nächsten Fenster zu gelangen.
Klicken Sie im ersten Bild manuell auf die Mitte der Spitze des Auslegers, um die Spitzenposition in der Software darzustellen. Der Kreis, der die Spitzenposition darstellt, kann in der Größe manipuliert werden, indem sein Radius angegeben wird, um die Genauigkeit zu erhöhen. Klicken Sie auf Kalibrieren, um die Position der Cantilever-Spitze in allen Bildern automatisch zu erkennen.
Bestätigen Sie die Genauigkeit der Spitzenerkennung, indem Sie die Bilder durchgehen. Klicken Sie auf Weiter und dann auf Fertig stellen, um die optische Überlagerung abzuschließen. Bewegen Sie als Nächstes die Bühne, um einen kollagenreichen Bereich innerhalb des grünen Felds zu positionieren, der auf der Registerkarte Datenanzeige sichtbar ist, indem Sie das polarisierte Bild verwenden.
Wählen Sie den kollagenreichen Bereich aus, indem Sie den Bereich unter der Rasterregisterkarte definieren und dann mit langem Drücken der linken Maustaste innerhalb des angegebenen grünen Felds ein Rechteck auf der Registerkarte Datenanzeige erstellen. Klicken Sie auf Neuen Scanbereich bestätigen, um den ausgewählten Bereich als Messbereich festzulegen. Stellen Sie die Parameter der Rückkopplungsschleife ein.
Setze I Verstärkung bei 50 Hertz und P Verstärkung bei 0,001. Stellen Sie dann den Sollwert auf einen Nano-Newton ein. Wählen Sie den relativen Sollwert entsprechend den untersuchten mechanischen Eigenschaften des Materials und der Steifigkeit des Auslegers.
Geben Sie eine gerade Basislinie an, um die Kraftkurven richtig anzupassen. Wählen Sie dann die Länge der Cantilever-Bewegung in der Z-Achse entsprechend der Oberflächentopographie der Probe. Stellen Sie die Z-Bewegung auf konstante Dauer ein.
Stellen Sie die Verlängerungszeit auf eine Sekunde ein, wobei die Verlängerungs- und Rückzugsverzögerungen auf Null gesetzt sind. Stellen Sie die Abtastrate auf 5.000 Hertz ein. Markieren Sie ein Häkchen vor dem Z Closed Loop, um den Abstand zwischen der Probe und der Cantileverspitze während der Messungen automatisch anzupassen.
Deaktivieren Sie dann die motorisierte Bühnensteuerung, indem Sie die Aktivieren-Taste deaktivieren. Schalten Sie den Laser ein und nähern Sie sich der Probe mit dem Ausleger. Klicken Sie auf Scan starten, um Kraftabstandskurven zu sammeln.
Analysieren Sie die erfassten Daten mit der Open-Source-Software AtomicJ. Laden Sie die Kraftkurven in das Programm, indem Sie auf das Symbol Prozesskraftkurven und Kennfelder klicken. Fügen Sie dann im Bearbeitungsassistenten die zu analysierenden Karten hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken.
Nachdem die Karten geladen sind, klicken Sie auf Weiter. Geben Sie die Verarbeitungseinstellungen im nächsten Fenster an. Um den Kontaktpunkt zwischen der Probe und dem Ausleger automatisch anhand eines Satzes von Passkurvenparametern zu schätzen, verwenden Sie die automatische Schätzung des Kontaktpunktes.
Bestimmen Sie den Kontaktpunkt zwischen dem Cantilever und der Probe nach der klassischen fokussierten Rastermethode. Wählen Sie die Schätzmethode als modellunabhängige Methode, um die beste Bestimmung des Kontaktpunktes basierend auf der Qualität der gemessenen Kraftkurven zu erhalten, die bei der Optimierung der Datenanalyse empirisch ermittelt werden muss. Passen Sie die Krafteindringkurve mit einem klassischen Modell als klassisches L zwei für die Modellanpassung an.
Stellen Sie die Anpassung des Modells an die Entnahmekurve ein. Stellen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,45 ein, wie für Weichteile wie die Leber empfohlen. Legen Sie die Anpassung der Kurve mit einem Basisliniengrad von drei und einem Kontaktgrad von eins fest.
Ändern Sie den Grad der Polynomanpassung basierend auf der Skala der Abweichungen der Kurven vom Modell. Wählen Sie als Sneddon-Modell das Modell aus, das für die Rücknahmekurven verwendet wird. Füllen Sie den Radius der kugelförmigen Spitze auf 2,9 Mikrometer aus.
Laden Sie die Federkonstante und invOLS aus den Datendateien, indem Sie das Einlesen aktivieren, und klicken Sie dann auf Fertig stellen. Gehen Sie nach der Datenanalyse die Kraftkurven durch. Schließen Sie die Kraftkurven aus, bei denen sich der Ausleger der Oberfläche des Leberabschnitts falsch näherte.
Diese Kurven haben hohes Rauschen und abweichende Formen. Danach können die Daten kopiert oder exportiert werden. In dieser Studie wurden leicht fixierte Leberabschnitte, die von den Kontrollmäusen und Mäusen mit leichter und fortgeschrittener Fibrose erhalten wurden, die durch die Injektion von Tetrachlorkohlenstoff induziert wurden, mit AFM untersucht.
Bereiche in der Nähe der zentralen Venen, die den Bereichen entsprechen, in denen sich normalerweise Kollagenfasern in Tetrachlorkohlenstoffmäusen bilden, wurden in Kontrolllebern analysiert. Die Verteilung der Young-Module war über verschiedene Regionen in Kontrolllebern und kollagenreichen Bereichen innerhalb eines einzigen Leberabschnitts reproduzierbar. In mit Tetrachlorkohlenstoff behandelten Mäusen zeigten Steifigkeitskarten, die den perizentralen Bereichen von Kollagenablagerungen entsprechen, signifikant höhere Werte der Young-Moduli im Vergleich zu äquivalenten Bereichen bei Kontrollmäusen.
Darüber hinaus gab es einen signifikanten Anstieg der Werte der Young-Module bei längerer Behandlung. Die Wirkung einer längeren Lagerung von Leberabschnitten auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagenfasern wurde ebenfalls bewertet. AFM-Messungen zeigten signifikant niedrigere Werte der Young-Module in kollagenreichen Bereichen für Abschnitte, die drei Monate gelagert wurden, verglichen mit denen, die innerhalb von zwei Wochen erhalten wurden.
Der Zeitpunkt der Fixierung des Leberabschnitts bestimmt stark die mechanischen Eigenschaften des Leberabschnitts. Wir empfehlen, dass die im Protokoll angegebenen Zeitintervalle strikt eingehalten werden müssen. Nach bestimmten Optimierungen im Protokoll kann die angegebene Methode für alle Weichteile verwendet werden, die eine signifikante Kollagenablagerung aufweisen, die durch Polarisationsmikroskopie nachweisbar ist.
Die gegebene Technik bietet den Forschern ein einheitliches und bequemes Protokoll, um den Mechanismus der Leber über gesunde und Krankheit zu untersuchen.
