La connaissance de la biodisponibilité du fer est essentielle pour l’évaluation de la qualité nutritionnelle du fer dans les aliments. L’essai biologique sur cellules Caco-2 a été mis au point pour répondre à ce besoin de recherche critique. Ce test biologique est une approche rentable et à haut débit pour déterminer la biodisponibilité du fer à partir de différents régimes.
Il peut être utilisé pour caractériser les facteurs influençant la biodisponibilité du fer et affiner les objectifs de l’étude in vivo. La procédure sera présentée par Yongpei Chang, un technicien de recherche de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez les cellules Caco-2 pendant 7 à 10 jours et, une fois que suffisamment de cellules sont disponibles, ensemencez les cellules dans un flacon non enrobé de collagène.
Ensuite, cultivez les cellules dans des flacons pendant sept jours et changez le milieu un jour sur deux. Le septième jour, utilisez les cellules pour ensemencer les plaques multipuits. Ensemencer les cellules Caco-2 à une densité de 50 000 cellules par centimètre carré dans six plaques bien enrobées de collagène.
Ajouter DMEM complété par HEPES, FBS et 1% de solution antimycotique antibiotique aux plaques. Puis incuber pendant 12 jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Continuez à changer le milieu au moins tous les deux jours selon un horaire quotidien cohérent.
Ensuite, préparer le milieu essentiel minimum complété par des tuyaux, une solution antimycotique antibiotique, de l’hydrocortisone, de l’insuline, du sélénium, de la triiodothyronine et du facteur de croissance épidermique. Remplacez le milieu de culture par deux millilitres de ce milieu préparé. Le lendemain, remplacez-le par un millilitre du milieu essentiel minimum à pH 7.
Créez maintenant une bague d’insertion stérilisée à l’aide d’un joint torique en silicone équipé d’une membrane de dialyse lavée à l’acide. Le 13e jour, retirez les inserts du réfrigérateur, égouttez et remplacez l’eau par de l’acide chlorhydrique 0,5 molaire. Laissez-le dans une hotte à flux laminaire pendant au moins une heure avant de l’utiliser.
Ensuite, égoutter 0,5 molaire d’acide chlorhydrique et rincer avec de l’eau stérile de 18 mégaohms. Conserver dans de l’eau stérile de 18 mégaohms dans une hotte à flux laminaire jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Créez un système à deux chambres en insérant un anneau dans les puits contenant les cellules de la plaque de six puits, puis renvoyez la plaque avec les inserts à l’incubateur.
Pour préparer la solution pancréatine-bile, ajoutez 87,5 grammes de résine échangeuse de cations faibles à la pancréatine solubilisée et à l’extrait biliaire et utilisez un agitateur pendant 30 minutes à température ambiante pour mélanger les composants. Versez la boue dans une grande colonne et égouttez la colonne. Centrifuger ensuite l’éluant de la colonne.
Peser l’échantillon dans un tube à centrifuger stérile de 50 millilitres. Ajustez le pH à l’aide d’acide chlorhydrique et ajoutez 10 millilitres de solution saline physiologique contenant 140 millimolaires de chlorure de sodium et cinq millimolaires de chlorure de potassium. Ensuite, réglez le processus de digestion gastrique en ajoutant 0,5 millilitre de la solution de pepsine porcine préparée à l’échantillon.
Ensuite, incuber sur un agitateur à bascule à un réglage doux pendant une heure à 37 degrés Celsius et initier le processus de digestion intestinale de chaque échantillon en ajustant le pH à 5,5 à 6,0 avec 1,0 molaire de bicarbonate de sodium. Ajouter 2,5 millilitres de la solution biliaire de pancréatine à chaque tube d’échantillon et ajuster le pH à 6,9 à 7,0 avec 1,0 molaire de bicarbonate de sodium. En utilisant la solution contenant 140 millimolaires de chlorure de sodium et cinq millimolaires de chlorure de potassium, ajouter des liquides de sorte que chaque tube contienne exactement 15 grammes de matière totale.
Maintenant, transférez 1,5 millilitre de chaque digestion intestinale dans la chambre supérieure du puits contenant les cellules Caco-2 de la plaque de culture des six puits. Remplacez le couvercle de la plaque et incuber à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5 % sur un agitateur à bascule à six oscillations par minute pendant deux heures. Retirez la bague d’insertion avec le digest.
Ajoutez ensuite un millilitre de milieu essentiel minimum à pH 7 à chaque puits et conservez la plaque dans l’incubateur pendant 22 heures. Maintenant, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez deux millilitres d’eau de 18 mégaohms à la couche mono cellulaire. Transférez-le dans un sonicateur et récoltez le lysat cellulaire entier dans des tubes de microcentrifugation pour les analyses de protéines cellulaires et de ferritine cellulaire.
Les variétés de manteca ont montré une plus grande disponibilité en fer par rapport aux contrôles de référence des classes de couleurs modélisées blanc et rouge pendant deux années de récolte consécutives. La biodisponibilité du fer des variétés de haricots blancs et jaunes a augmenté après leur transformation en farine. Cependant, la biodisponibilité du fer a montré une diminution des variétés canneberge, rein rouge et noir.
Une culture appropriée de la monocouche cellulaire Caco-2 est essentielle pour le succès de l’utilisation de ce bioessai. Une attention précise aux détails de la croissance et de l’entretien est essentielle à la réponse cohérente du bioessai. Ce modèle annule les inconvénients et le coût élevé d’autres approches et permet aux chercheurs d’identifier les mécanismes et d’évaluer plus complètement les facteurs qui inhibent et favorisent la biodisponibilité du fer.
