Ce protocole est important car il permet d’identifier l’interaction plante-champignon. En plus de colorer la pectine, il démontre également des défauts sur le polymère de paroi cellulaire pathogène et permet l’identification des structures de champignons. Cette technique simple et simple peut être réalisée en microscopie optique et ne nécessite aucun équipement coûteux tel que le microscope électronique à balayage.
De plus, c’est une technique rapide qui permet d’obtenir une excellente distinction des structures végétales pour les études histopathologiques. La technique identifie l’interaction plante-champignon. Par conséquent, il collabore pour diagnostiquer les maladies causées par des champignons biotrophes et nécrotrophes tels que la rouille du café et la cércospose.
Pour commencer, récoltez un échantillon de feuilles d’environ 10 millimètres carrés dans la région médiane de la lésion à l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler, puis immergez-le dans 30 millilitres de solution fixatrice karnovsky. Soumettre l’échantillon de feuilles à un vide faible de 500 à 600 millibars pendant 15 minutes à l’aide d’une pompe à huile, au moins quatre fois pour augmenter la perméabilité de la solution fixatrice dans le tissu foliaire. Après fixation, laver l’échantillon de feuilles trois fois dans un tampon de cacodylate de 0,5 M dilué dans de l’eau distillée pendant cinq minutes chacun, puis le transférer dans une série éthanolique graduée pendant 15 minutes à chaque concentration d’éthanol.
Pour transférer progressivement les échantillons en méthacrylate de glycol, faites la solution A en mélangeant le gramme de poudre de méthacrylate de glycol avec 100 millilitres de résine de base sous agitation magnétique. Ensuite, immergez les échantillons dans le rapport un à deux de la solution A et de l’éthanol à 100% pendant trois heures. Immerger les échantillons dans un rapport un à un pour la solution A: 100% éthanol pendant trois heures, puis immergé dans une résine de base pure pendant deux à quatre jours.
Soumettre l’échantillon à un vide faible au moins quatre fois par jour pendant 15 minutes, suivi d’une rotation. Mélanger 15 millilitres de solution A avec un millilitre du durcisseur dans un bécher avec rotation pendant deux minutes pour produire la solution de polymérisation B.Mettre 1,2 millilitres de cette solution de polymérisation B dans des moules en plastique. À l’aide d’un pic en bois, transférez les échantillons de feuilles sectionnées de la résine de base pure à la solution B et évitez d’utiliser une pince à épiler car elles peuvent provoquer un écrasement des tissus.
Assurez-vous d’orienter rapidement les échantillons de feuilles perpendiculairement aux moules en plastique car la solution B devient rapidement visqueuse. Lorsque l’orientation perpendiculaire des échantillons de feuilles est atteinte, attendez 30 minutes, puis transférez le moule en plastique dans une chambre en plastique ou en verre contenant du gel de silice pour éviter l’humidité. Une fois que la résine et l’échantillon de feuille sont polymérisés après deux à trois heures, détachez le bloc résultant du moule en plastique en ponçant la base du bloc avec une lime de ponçage.
Ensuite, collez le bloc sur un morceau de bois. Coupez le bloc en sections de cinq micromètres d’épaisseur à l’aide d’un microtome rotatif équipé de lames en acier de huit centimètres. Placez les sections sur des lames de verre recouvertes d’eau distillée.
Ensuite, transférez les lames sur une plaque chauffante pour sécher à 40 degrés Celsius et favorisez l’adhérence des sections aux lames en verre. Après séchage, étiquetez les lames de verre avec le nom de référence du bloc et le numéro de la diapositive. Couvrir les sections avec deux millilitres de bleu de coton à 5% de lactophénol et les chauffer sur une plaque chauffante à 45 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée. Tachez-le avec deux millilitres de 0,01% de ruthénium rouge dans l’eau pendant une minute. Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée.
Placez une goutte d’eau distillée sur les sections et couvrez les sections avec un couvercle pour effectuer une analyse en microscopie optique. Dans la méthode de double coloration, les hyphes d’Hemileia vastatrix contenant des parois cellulaires et la teneur dense en protoplastes sont apparus bleu foncé dans le parenchyme spongieux et palissade. La cellule mère haustorium et l’haustoria présentaient également une couleur bleu foncé.
La contre-coloration avec du rouge ruthénium a clairement défini la distribution fongique dans les espaces intercellulaires. Au cours de l’interaction, la cellule mère d’Hemileia vastatrix haustorium a brisé la paroi de la cellule hôte et a développé un cou haustorial entouré de composés pectiques. L’encapsulation rose-rouge riche en pectine du cou haustorial ne peut empêcher la formation haustoriale.
Dans certains cas, l’encapsulation riche en pectine a enveloppé l’haustorium de manière incomplète. Et dans certains cas, l’haustorium est entièrement encapsulé. La paroi cellulaire riche en pectine maintient l’intégrité à la frontière de la lésion, où le champignon n’est pas présent.
La méthode de double coloration a démontré la présence d’hyphes intercellulaires. Dans les zones d’interaction, les parois cellulaires de la pectine semblaient perdre leur intégrité en raison de la dissolution. Des structures reproductrices telles que des conidies ont été trouvées dans l’épiderme adaxial.
Les hyphes de Cercospora coffeicola ont été trouvés dans la chambre substomatique sous forme de structures de curling, et le parenchyme de palissade dans la région de la lésion semble subir une lyse de la paroi cellulaire. Évitez d’utiliser une pince à épiler car elles peuvent provoquer un écrasement des tissus. D’autres études histopathologiques sur les rouilles, l’anthracnose, la cércospoliose, les smuts et d’autres interactions biotrophes, hémibiotrophes et nécrotrophes entre les plantes et les champignons devraient être menées pour étudier l’utilisation potentielle de cette technique dans différents pathosystèmes.
