L’extraction des molécules de glycogène hépatique pour la détermination de la structure du glycogène

Ce protocole permet d’extraire les molécules de glycogène hépatique de manière à préserver leur structure et à limiter la quantité de petites particules de glycogène perdues. Avec des recherches antérieures montrant que le diabète modifie la structure du glycogène, cette méthode pourrait fournir dans l’étude du diabète et des diverses maladies de stockage du glycogène. Pour extraire le glycogène du foie, commencez par transférer un gramme de tissu hépatique congelé dans un tube de 15 millilitres contenant six millilitres de tampon d’isolement de glycogène.

Tout en restant sur la glace, homogénéisez le tissu hépatique à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire. Une fois terminé, transférez la moitié ou trois millilitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube, puis faites bouillir pendant 10 minutes. Conservez l’autre moitié de la suspension sur de la glace pour extraire les protéines associées contenant du glycogène qui ne sont pas dénaturées.

Pour déterminer la teneur en glycogène, retirez une aliquote de huit microlitres de chaque tube et gardez le tube sur de la glace. Après avoir fait tourner la suspension restante à 6 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, transférez le surnageant dans des tubes à ultracentrifuger pour les centrifuger à 3,6 fois 10 au cinquième G et à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Après avoir éliminé les surnageants restants, remettez les pastilles en suspension dans 1,5 millilitre de tampon d’isolement de glycogène.

Ensuite, superposez les échantillons sur 1,5 millilitre de solution de saccharose à 30 % dans quatre tubes à ultracentrifuger de quatre millilitres, suivis d’une centrifugation comme décrit précédemment pendant deux heures. Après avoir éliminé les surnageants, remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres d’eau déminéralisée. Pour précipiter le glycogène de la suspension cellulaire, ajoutez 800 microlitres d’éthanol absolu aux suspensions cellulaires et mélangez bien.

Ensuite, conservez les mélanges à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure pour permettre les précipitations. Une fois que la précipitation se produit, centrifugez les échantillons à 6 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et remettez en suspension la pastille de glycogène dans 200 microlitres d’eau déminéralisée pour répéter le processus de précipitation à l’éthanol trois fois. De la suspension cellulaire finale, retirez une aliquote de huit microlitres de chaque tube pour déterminer la teneur en glycogène.

Ensuite, congelez les surnageants restants dans de l’azote liquide et lyophilisez-les pendant la nuit. Le lendemain, conservez les échantillons de glycogène séché au congélateur à moins 20 degrés Celsius. L’étude a analysé la pureté, le rendement brut et le rendement en glycogène de l’échantillon de glycogène séché extrait dans différentes conditions.

Il n’y avait pas de différences significatives dans le rendement en brut et le rendement en glycogène entre les groupes extraits dans les diverses conditions. En revanche, la pureté du glycogène a été significativement influencée par les concentrations de saccharose et l’ajout d’une étape d’ébullition. Le glycogène de la plus haute pureté a été extrait à l’aide d’une concentration de 30 % de saccharose et d’une étape d’ébullition de 10 minutes.

Le glycogène a été extrait de l’homogénat hépatique à 30 %, 50 % ou 72,5 % de saccharose, bouilli ou non bouilli, afin d’évaluer les effets des différentes conditions sur la taille des molécules de l’extrait final. L’analyse de la longueur de la chaîne a été effectuée sur six foies bouillis et non bouillis, en utilisant des concentrations de saccharose de 30 %, 50 % et 72,5 %. La teneur en molécules de glycogène ou particules bêta avec un rayon hydrodynamique, HR, inférieur à 30 nanomètres a été calculée.

Les échantillons bouillis présentaient des valeurs moyennes d’HR plus faibles et une teneur en particules plus élevée que les échantillons non bouillis. De plus, des concentrations plus faibles de saccharose ont entraîné des valeurs d’HR plus faibles et des teneurs en particules bêta plus élevées. L’introduction d’une étape d’ébullition a également conduit à une baisse de l’HR max ou des valeurs maximales, tandis que la concentration de saccharose n’a pas eu d’effet significatif.

Assurez-vous que le tissu est complètement homogénéisé et qu’il n’en reste aucun morceau. Ainsi, cette technique nous ouvre la voie à l’exploration des chemins qui relient les plus petites particules bêta entre elles pour former les plus grandes particules alpha.