En tant que modèle animal puissant dans les études neurodégénératives et comportementales, C. elegans peut être utilisé pour dépister et évaluer efficacement les composés toxiques contre la neurotoxicité de la polyglutamine en utilisant des modèles semblables à la maladie de Huntington. Le principal avantage de cette technique est le profilage et l’intégration de phénotypes multiples dans différents modèles de C.elegans. Aussi en fait comme C.elegans modèles sont utilisés dans cette méthode.
Il fournit une taille dans le dépistage et la recherche de candidats thérapeutiques pour d’autres retards neurodégénératifs et même d’autres retards. Veuillez faire attention aux températures utilisées dans la croissance de C. elegans et effectuer le test aux bons stades de développement namical. Jiang Yiyi, Xioa Yue et Wang Qiangqiang, trois étudiants diplômés, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par transférer 300 à 500 larves L1 synchronisées de nématodes AM141 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits contenant 500 microlitres de milieu S contenant la souche OP50 d’E. coli et cinq milligrammes par millilitre d’astragalane. Scellez la plaque avec du parafilm et incuber à 20 degrés Celsius et 120 rotations par minute pour les intervalles de temps souhaités. Transférer les nématodes dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre et laver trois fois avec un tampon M9 par centrifugation pour éliminer les cellules OP50 restantes.
Ensuite, remettez en suspension les nématodes AM141 dans le tampon M9. Maintenant, transférez 10 à 15 nématodes dans chaque puits dans une plaque de 384 puits, en plaçant 10 puits de réplication pour chaque traitement et ajoutez 10 microlitres d’azoture de sodium de 200 millimolaires à chaque puits pour paralyser les nématodes en leur permettant de se déposer au fond. Placez la plaque dans un système d’imagerie à haut contenu pour acquérir des images fluorescentes.
Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et configurez les paramètres mentionnés dans le manuscrit texte. Analysez les données d’image en ouvrant la fenêtre de données de la plaque de révision et en sélectionnant la plaque d’essai pour l’analyse de l’image. Double-cliquez sur un puits de test pour afficher son image.
Sélectionnez ensuite les noyaux de comptage comme méthode d’analyse et cliquez sur le bouton Configurer les paramètres. Définissez l’image source à partir du canal FITC et sélectionnez l’algorithme standard. Définissez les paramètres d’analyse d’image comme décrit dans le manuscrit texte et testez-les pour optimiser la méthode d’analyse.
Enregistrez les paramètres et exécutez l’analyse sur tous les puits. Exportez les noyaux totaux sous forme de nombre total d’agrégats Q40:YFP dans chaque puits. Compter le nombre de nématodes dans chaque puits et calculer le nombre moyen d’agrégats Q40:YFP par nématode dans chaque groupe.
Ensuite, calculez l’indice d’inhibition. Pour préparer les nématodes à l’essai de neurotoxicité polyQ, transférer 300 à 500 larves L1 synchronisées de nématodes HA759 dans chaque puits d’une plaque de 48 puits contenant 500 microlitres de milieu S contenant la souche OP50 d’E. coli et cinq milligrammes par millilitre d’astragalane. Après avoir scellé les plaques, incuber, récolter et remettre en suspension les nématodes dans un tampon M9 comme démontré précédemment.
Maintenant, préparez dans un tampon d’agarose en ajoutant deux grammes d’agarose à 100 millilitres de tampon M9 et chauffez la solution au micro-ondes jusqu’à ébullition. Distribuer 0,5 millilitre d’agarose fondue au centre d’une lame de verre de microscopie d’un millimètre d’épaisseur placée entre deux morceaux de plaques de verre de deux millimètres d’épaisseur, recouvrant d’une autre lame verticalement. Retirez délicatement la lame supérieure une fois que l’agarose refroidit et est solidifiée.
Commencez le test de survie neuronale ASH en ajoutant une goutte de 20 millimolaires d’azoture de sodium sur la plateforme agros, puis en transférant 15 à 20 nématodes HA759 dans la goutte pour les immobiliser. Placez un couvercle doucement sur les nématodes. Maintenant, gardez la lame sous un microscope à fluorescence équipé d’un appareil photo numérique.
Sélectionnez une lentille d’objectif 40x et un filtre FITC pour détecter les neurones ASH positifs GFP dans la région de la tête des nématodes. Sélectionnez plus de 50 nématodes dans chaque groupe au hasard pour compter le nombre de nématodes avec des neurones ASH bilatéraux marqués GFP dans leur région de tête, puis calculez le taux de survie des neurones ASH. Pour le test d’évitement osmotique, divisez une plaque de NGM sans nourriture en zones normales et zones de piégeage en créant une ligne de glycérol à huit molaires au milieu.
Ensuite, étaler une ligne d’azoture de sodium de 200 millimolaires à environ un centimètre de la ligne de glycérol pour paralyser les nématodes traversant la barrière glycérique dans la zone de piège. Transférer environ 200 nématodes chacun sur la zone normale de trois plaques répliquées pour chaque groupe. Ensuite, ajoutez une goutte de 1% de butanedione sur la zone de piège pour attirer les nématodes.
Couvrir immédiatement le couvercle de la boîte de Petri et incuber à 23 degrés Celsius pendant 90 minutes. Évaluez le nombre de nématodes sur les deux zones au microscope et calculez l’indice d’évitement. La souche polyQ transgénique AM141 exprime fortement les protéines de fusion Q40:YFP dans les cellules musculaires de la paroi corporelle, identifiées par ce protocole automatisé d’imagerie et d’analyse, dont la quantité croissante a été inhibée par le traitement astragalan démontrant son potentiel protecteur.
Une perte de fluorescence GFP et de neurones ASH bilatéraux dans les régions de la tête des nématodes indique la mort neuronale ASH. Ce test de survie neuronale ASH peut être utilisé pour évaluer visuellement l’effet neuroprotecteur des composés de test sur les neurones d’élégance Caenorhabditis. Le test d’évitement chimiosensoriel a été utilisé pour examiner les échantillons de test efficaces sur la perte fonctionnelle des neurones ASH médiée par l’agrégation polyQ.
L’indice d’évitement des nématodes HA759 traités à l’astragalane à 15 degrés Celsius pendant trois jours a augmenté à plus de 0,6, démontrant un effet neuroprotecteur du polysaccharide contre les troubles du comportement. Pour évaluer la capacité neuroprotectrice globale des composés d’essai, les données des tests individuels ont été intégrées et présentées sous la forme d’un tableau radar montrant l’aire du triangle dans le groupe de traitement astragalane supérieure à celle du groupe témoin, indiquant les effets anti-polyQ du polysaccharide. Veuillez garder à l’esprit que la nourriture, la température et l’humidité peuvent affecter leur comportement de C. elegans.
