À ce jour, les organoïdes cérébraux différenciés des cellules souches pluripotentes sont un modèle 3D vitro le plus proche du tissu cérébral humain natif. En outre, les organoïdes cérébraux conviennent également à la modélisation de diverses pathologies du système nerveux central, au test de substances pharmacologiquement actives et à une utilisation en médecine régénérative. Pendant ce temps, cette technologie en est encore au stade initial de développement.
Le protocole peut être divisé en deux groupes en fonction de la méthode d’obtention des agrégats et de la culture ultérieure avec différenciation. Le premier comprend le protocole et les schémas de différenciation, différents dans le temps de culture et les inducteurs de différenciation avec maturation ultérieure de l’organoïde dans le shaker dans des dispositifs spéciaux à faible adhérence comme les tubes ou les plaques de marché. Un autre groupe comprend l’utilisation d’un bioréacteur spécial.
L’analyse de divers protocoles a montré que les organoïdes doivent être cultivés dans des conditions de milieu nutritif circulant. Cependant, l’absence de systèmes simples et peu coûteux pour obtenir des organoïdes de taille et de morphologie standard nécessite le développement de tels dispositifs pour la mise à l’échelle du processus. Dans ce travail, nous décrivons notre méthode d’obtention et de test de mini bioréacteurs simples et peu coûteux qui permettent d’obtenir de grandes quantités d’organoïdes de haute qualité.
Coupez les tubes de centrifugeuse stériles de 15 millilitres dans les anneaux, de 7 ou 8 millimètres de hauteur. Autoclavez les anneaux. Briser les faibles agrégations sur les boîtes de Petri traitées ou microbiologiques en miettes.
Dissoudre environ 1 gramme de miettes de plastique dans 10 millilitres de chloroforme pendant la nuit pour préparer un plastique liquide. Faites un bouton en plastique au centre d’une boîte de Petri stérile ultra basse adhérence de 6 centimètres. Il existe deux façons également appropriées.
Le premier, placez l’autoclave dans un anneau en plastique sur un centre et appliquez des demi-millilitres de plastique liquide à l’intérieur de l’anneau. Le second, sans anneaux en plastique, laisse tomber des demi-millilitres de plastique liquide sur le centre de la boîte de Pétri. Laissez la vaisselle ouverte pendant 2 ou 3 heures dans une hotte à écoulement laminaire jusqu’à séchage complet.
Cultiver des cellules souches pluripotentes induites dans le milieu pour les cellules souches pluripotentes, jusqu’à 75 ou 90% de confluence dans les boîtes de Petri de 35 millimètres, pré-enduites d’une matrice dissoute dans le milieu Froid Dulbecco Modified Eagle Medium, et fisher-12 milieu. Préparer le milieu A plus le remplacement du sérum. Cultiver des cellules souches pluripotentes induites pendant 1 jour dans le milieu avec remplacement sérique.
Changer le milieu des cellules souches pluripotentes en un milieu de remplacement sérique au jour zéro de la différenciation. Préparez le médium A.Changez le médium en moyen A au jour 2 de la différenciation. Cultivez des cellules en milieu A pendant 2 semaines, en milieu rafraîchissant dans des boîtes de Pétri tous les 2 jours.
Au jour 14, commencez la formation de sphéroïde à l’aide d’une plaque de culture spéciale de 24 puits qui contient environ 1 200 micropuits dans chaque puits. Préparez une plaque de culture de 24 puits avec des micropuits. Ajouter à chaque puits 1 millilitre de milieu A, centrifuger brièvement à 1 300 g pendant 5 minutes dans un rotor à godet oscillant équipé d’un porte-plaque.
Contrôlez au microscope qu’il n’y a pas de bulles dans les micropuits. Préparez le milieu B.Retirez le milieu de la boîte de Pétri. Pour le détachement cellulaire, traiter les cellules avec une solution d’EDTA de 1,5 millilitre préparée sur PBS.
Contrôlez le détachement de la cellule au microscope. Récoltez la cellule dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 5 millilitres de dulbecco mélangé et de milieu Fisher dans le tube vers les cellules.
Centrifuger à 200g pendant 5 minutes. Retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans 2 millilitres de milieu B.Transférez la suspension de cellules contenant 1 milliard de cellules dans chaque puits d’une plaque de 24 puits avec des micropuits. Pipettez doucement les cellules jusqu’à plusieurs fois et centrifugez brièvement 100 g pendant 1 minute pour capturer la cellule dans les micropuits.
Contrôlez au microscope que les cellules sont réparties uniformément dans des micropuits. Incuber la plaque pendant la nuit pour l’agrégation cellulaire dans les sphéroïdes. Le lendemain matin, jour 15, vérifiez au microscope la qualité des sphéroïdes, qui sont transparents et lisses s’ils sont sains.
Recueillez soigneusement les sphéroïdes de chaque puits dans un tube de 15 millilitres, laissez les sphéroïdes précipiter par gravité pendant 2 et 3 minutes, puis retirez le surnageant. Ajouter aux sphéroïdes 2 millilitres de la matrice, décongelés et ex tempore sur glace. Mélanger doucement par pipetage et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
Pour laver l’excès de matrice, ajouter au tube 8 millilitres de milieu B.Pipette doucement, puis centrifuger le tube pendant 1 minute à 100g. Retirez le surnageant. Ajouter au tube 20 millilitres de milieu B, pipeter doucement, puis répartir la suspension sphéroïde entre les mini-bioréacteurs.
Placez ensuite les mini-bioréacteurs dans une boîte de Petri de 15 centimètres, ce qui empêche l’évaporation de l’eau et la contamination. Placez la boîte de Petri avec des mini-bioréacteurs sur un agitateur orbital. Cultivez les organoïdes à une vitesse de rotation de 70, 75 tr / min.
Le jour 16, préparez le milieu C.Transférer l’organoïde dans un tube de 50 millilitres. Pendant 5 minutes, laissez-les tomber au fond. Aspirer le surnageant et ajouter 5 millilitres du milieu C.Rejoignez les organoïdes dans les mini-bioréacteurs.
Cultivez les sphéroïdes en C moyen pendant 2 semaines, en rafraîchissant le milieu tous les 2 jours. Pendant ces 2 semaines, sélectionnez environ 100 sphéroïdes par mini bioréacteurs pour la culture suivante. Le jour 30, préparez le milieu D.Changez le milieu de culture en milieu D, qui est un milieu de maturation.
Rafraîchir le milieu de culture tous les 2 ou 3 jours pendant 3 semaines. Utilisez ensuite le milieu D dissous dans F et GDNF. Après 1 mois de culture consécutive dans les milieux A et B, des organoïdes standardisés en taille et morphologie sont obtenus.
Au fur et à mesure qu’il grandit, ils doivent changer le milieu plus souvent, jusqu’à 4 fois par semaine augmente également. Après 2 mois de culture, ils atteignent 4 et 5 millimètres de diamètre. Et après un autre mois, 5 et 6 millimètres et la croissance s’arrête.
La figure montre l’apparition d’une enzyme organoïde, des sections claires peintes avec de l’hématoxyline et de l’éosine. L’analyse immunohistochimique pendant 1 mois montre la présence de grappes SOX2 positives de cellules progénitives, y compris à l’intérieur de la partie centrale. Dans la périphérie des organoïdes, la protéine acide fibrillaire gliale, la protéine 2 associée aux microtubules et l’hydrolase de thiazine positive.
Les cellules sont concentrées, ce qui correspond à la forme mature des neurones. Dans certains cas, des grappes de blancs sur la zone nécrotique se forment dans la partie centrale. Cela indique la limitation de ce protocole pour l’obtention d’organoïdes plus gros.
Très probablement, le facteur limitant de la croissance est le taux de diffusion des nutriments et de l’oxygène. Les différents types de médias et de cellules de sphéroïdes et le test de notre système pour certains types d’organoïdes. Beaucoup de cerveau et de rétine, des organoïdes combinés à partir de cellules de carcinome du foie et de cellules souches mésenchymateuses, des organoïdes combinés à partir d’appels de tige mésenchymateuses de blast capital et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques à partir de cellules souches pluripotentes induites et d’organoïdes intestinaux.
Était-ce variable dans la composition initiale des cellules? Facteurs de différenciation, culture et milieu, matrice extracellulaire, et éventuellement aussi la composition du mélange gazeux, le taux de rotation de la plate-forme et d’autres paramètres. Il sera possible d’obtenir un organoïde avec la même forme, la même taille ou le même modèle morphologique dans divers organes et tissus.
L’utilisation de mini-bioréacteurs proposée dans ce travail.
