Cette technique est importante car elle peut mesurer l’absorption du glucose dans des cellules spécifiques dans les tissus vivants de la drosophile. Le capteur basé sur FRET fournit une mesure directe des changements dans les niveaux de glucose intracellulaire. Cette technique permet aux chercheurs d’évaluer les changements dans les niveaux de glucose en temps réel, dans les motoneurones vivants à partir de modèles de SLA par rapport à des témoins.
Un aspect difficile est l’imagerie du même ensemble de neurones après avoir changé le tampon. Laisser l’échantillon sur le microscope permet de s’assurer que le VMC bouge le moins possible. Avant de commencer les dissections, allumez le microscope d’imagerie et les lasers.
Ensuite, recueillez une larve errante du troisième stade, rincez-la à l’eau distillée double et placez-la dans une goutte de tampon HL3 sur un plat tapissé d’élastomère préalablement préparé. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez une paire de pinces pour épingler les extrémités antérieure et postérieure de la larve, côté dorsal vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes. À l’aide d’une paire de ciseaux Iris inclinés, faites une incision juste au-dessus de l’épingle postérieure.
Ensuite, faites une coupe verticale de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve. Après avoir ajouté quelques gouttes de tampon HL3 si nécessaire, retirez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le système nerveux central. Ensuite, épinglez les volets, étirant la paroi du corps pour exposer le système nerveux central tout en gardant le système neuromusculaire intact.
Pour l’acquisition d’images, utilisez un microscope confocal vertical avec une lentille à immersion dans l’eau 40 fois. Sélectionnez ensuite le laser de 405 nanomètres pour exciter le CFP. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition tels que la vitesse de numérisation, la moyenne, l’objectif, la taille du sténopé du zoom et la résolution spatiale.
Ajustez le gain de manière à ce que le signal soit dans la plage dynamique optimale et utilisez les mêmes paramètres pour tous les génotypes. Pour imager les motoneurones dans le cordon nerveux ventral, placez le plat en silicone avec l’échantillon disséqué sous la lentille et abaissez la lentille de sorte qu’elle entre en contact avec le tampon HL3 de saccharose tréhalose. Assurez-vous que l’objectif est complètement immergé dans le tampon et ajoutez plus de tampon si nécessaire. Prochain.
À l’aide des canaux CFP et FRET, sélectionnez manuellement une sélection optique composée d’au moins six motoneurones au foyer situés le long de la ligne médiane du cordon nerveux ventral. Ensuite, acquérez des images toutes les 10 secondes pendant 10 minutes. Ces images représentent la ligne de base.
Pour la stimulation du glucose, retirez le saccharose tréhalose contenant un tampon HL3 à l’aide d’une pipette Pasteur et ajoutez cinq millimolaires de glucose supplémenté HL3 sans déplacer le cordon nerveux ventral. Ensuite, acquérez des images toutes les 10 secondes pendant 10 minutes supplémentaires. Ces images représentent la phase de stimulation.
Enregistrez les images en tant que fichiers CZI ou tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, la condition expérimentale et les canaux utilisés. Réutilisez les paramètres pour imager tous les génotypes. Pour le traitement de l’image, ouvrez le logiciel d’imagerie Fiji-ImageJ, puis ouvrez les fichiers CZI, choisissez la pile de vues avec hyper pile et définissez le mode couleur sur l’échelle de gris et sélectionnez diviser les couches en fenêtres séparées. Prochain.
Traitez les images à l’aide de plug-ins de correction de dérive, turbo reg et stack reg. Chaque canal est corrigé séparément en sélectionnant stack reg sous les plug-ins, puis en choisissant la transformation en traduction. Choisissez manuellement les régions d’intérêt ou les ROI en traçant tous les motoneurones qui restent au centre de l’attention sur l’ensemble de la série chronologique.
Ensuite, utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque contour de motoneurone. Utilisez la fonction multi-mesure pour mesurer la valeur grise moyenne dans chaque retour sur investissement à chaque point temporel. Copiez ensuite les retours sur investissement tracés du premier canal vers le deuxième canal pour l’image de pré-stimulation.
Pour l’analyse des données, calculez le rapport FRET par CFP en utilisant les valeurs grises moyennes pour les canaux FRET et CFP. Les changements dans les rapports FRET par CFP reflètent des altérations de la concentration intracellulaire de glucose. Ensuite, tracez les ratios FRET par CFP pour chaque retour sur investissement et point de temps par rapport au temps.
Un capteur de glucose à base de FRET génétiquement codé a été utilisé pour mesurer l’absorption du glucose dans les motoneurones. Lorsque le glucose n’est pas lié au capteur, l’excitation CFP provoque uniquement l’émission de CFP. Et lorsque le glucose se lie, le signal YFP peut être détecté en raison de FRET se produisant entre CFP et YFP.
Voici des images de signaux FRET et CFP dans les contrôles des capteurs de glucose dans les neurones mutants TDP-43 dans des conditions de base et de stimulation. Un motoneurone représentatif est décrit dans chaque image comme un exemple de retour sur investissement. Lors de la stimulation du glucose, les motoneurones de contrôle exprimant des capteurs de glucose présentent une légère augmentation de l’absorption du glucose, tandis que les neurones exprimant le TDP-43 ont montré une absorption significativement plus élevée du glucose.
D’autres rapports FRET par CFP des motoneurones mutants TDP-43 ont été normalisés aux contrôles des capteurs de glucose à chaque point temporel. Dans les conditions initiales, il n’y avait aucune différence entre les génotypes. Cependant, lors de la stimulation du glucose, une augmentation rapide et significative de l’absorption du glucose a été observée chez les mutants TDP-43 par rapport au témoin.
Dans une représentation graphique à barres, la stimulation du glucose dans les neurones exprimant le capteur de glucose a démontré une augmentation faible mais significative du rapport FRET par CFP par rapport à la ligne de base. En revanche, les neurones exprimant TDP-43 ont montré une augmentation significative du rapport lors de la stimulation par rapport à la ligne de base. La différence nette dans les rapports FRET par CFP entre les motoneurones exprimant le TDP-43 et le capteur de glucose est d’environ 10,9%La gestion du temps est essentielle pour cette procédure afin que les neurones ne meurent pas au cours de l’imagerie.
Il est important d’imager immédiatement après les dissections pour éviter cela. Cette technique a mis en évidence l’importance du métabolisme du glucose dans les neurones et a conduit notre groupe à étudier plus avant le rôle de la glycolyse dans la régénération des motoneurones.
