Les voies de signalisation contrôlant les systèmes multicellulaires sont dynamiques. Pour comprendre la fonction de ces dynamiques, il est essentiel de pouvoir moduler subtilement ces dynamiques sans affecter l’activité globale de signalisation. Ce protocole utilise un système microfluidique qui permet une dissection fonctionnelle des oscillations de signalisation dans le développement d’embryons de souris.
La dynamique de signalisation a été trouvée dans de nombreux tissus, y compris les tissus adultes. La microfluidique est un outil polyvalent qui peut être adapté à de nombreux systèmes modèles, y compris les cultures cellulaires, tissulaires et organoïdes. Pour commencer, préparez la quantité requise de PDMS en mélangeant le monomère avec le catalyseur dans un rapport de neuf pour un afin d’induire la polymérisation.
Utilisez des outils jetables et assurez-vous que le mélange est correctement réalisé. Placez le mélange PDMS dans un dessiccateur et appliquez le vide pendant environ 30 minutes pour éliminer l’air. Versez une couche PDMS d’environ trois à cinq millimètres dans le moule à copeaux et replacez-la dans le dessiccateur pendant environ 30 minutes.
Durcissez le moule en le plaçant dans un four pendant la nuit à 65 degrés Celsius ou moins selon le matériau du moule. Coupez la puce hors du moule à l’aide d’un scalpel. Percez les trous d’entrée et de sortie avec un poinçon de biopsie d’un millimètre à partir de l’intérieur de la chambre microfluidique.
Nettoyez la glissière de verre avec de l’air comprimé. Pour lier la puce à la lame de verre, placez la puce et la glissière de verre dans le four à plasma avec les côtés à coller vers le haut. Générez du plasma en utilisant le protocole spécifique à la machine utilisée, puis liez la puce au verre en plaçant les surfaces activées les unes sur les autres et en appliquant une pression uniforme.
Pour préparer le tube et la puce pour l’expérience, coupez le tube à un angle de 45 degrés et attachez une aiguille à chacun des tubes. Placez le tube avec des aiguilles, la puce et les bouchons dans un plat et stérilisez-les en les exposant à la lumière ultraviolette pendant environ 15 minutes. Pour recouvrir la puce de fibronectine, placez la puce dans un bécher contenant du PBS plus 1% de pénicilline ou de streptomycine à température ambiante.
Rincez la puce avec du PBS pour éliminer l’air avec une pipette P200. Chargez une seringue de trois millilitres pour chaque chambre de la puce. Fixez l’aiguille à la seringue contenant de la fibronectine et connectez la seringue à la pompe à seringue.
Rincer les tubes manuellement pour éliminer l’air. Fixez le tuyau de sortie à la sortie de la puce. Assurez-vous de pousser le tube jusqu’au fond et de régler un faible débit pour recouvrir la puce.
Laissez la pompe à seringue fonctionner pendant au moins deux heures ou pendant la nuit. Lorsque vous avez terminé, arrêtez la pompe et coupez le tube juste après l’aiguille. Préparez des seringues remplies du milieu pour l’expérience et dégazez à la fois le milieu de culture et la puce dans pbs.
Essayez de rincer ou d’aspirer la plupart des bulles d’air de la puce, puis installez des seringues dans les pompes et fixez le tuyau d’entrée aux seringues. Pour charger du tissu sur la puce, disséquez le bout le plus postérieur de la queue. Rincez la puce avec un milieu de culture avec 25 HEPES micromolaires pour retirer le PBS.
Chargez le tissu dans la puce à l’aide d’une pipette P200. Après chaque étape de chargement des tissus, fermez l’entrée de chargement des tissus correspondante à l’aide d’un morceau de tube rempli de PDMS. Pour assembler la configuration microfluidique, fixez le tube à la puce microfluidique sans obtenir de bulles d’air à l’intérieur.
Pour ce faire, assurez-vous qu’il y a une goutte de milieu présente à l’extrémité du tube. Une fois que tous les tubes sont attachés à la puce, sortez-les du bécher et placez-les dans un plat contenant un tissu humide. Mettez le plat et environ 1,5 mètre de tuyau d’entrée dans un incubateur pour la culture de nuit.
Assurez-vous d’une humidité élevée pour éviter la formation de bulles d’air pendant la culture. Alternativement, séchez l’extérieur de la puce et placez-la dans un support de microscope, puis placez le support et environ 1,5 mètre de tuyau d’entrée à l’intérieur de la chambre d’incubation d’un microscope inversé pour une expérience d’imagerie en direct. Après au moins 20 minutes de débit constant, commencez le pompage prévu pour l’expérience.
Pour entraîner la signalisation d’encoche dans l’embryon de souris en segmentation, utilisez un programme de pompage de 100 minutes de milieu et 30 minutes d’impulsions de médicament répétées jusqu’à la fin de l’expérience, généralement pendant 24 heures. Pour l’imagerie en temps réel, commencez l’imagerie après au moins 30 minutes. Pour confirmer l’entraînement des oscillations de signalisation, plusieurs expériences sont alignées en utilisant la synchronisation des impulsions du médicament et visualisées avec le colorant Cascade Blue.
Les oscillations quantifiées peuvent être détendances et affichées sous forme d’écart moyen et type ou de phases des oscillations peuvent être calculées. La relation de phase entre les oscillations des cultures embryonnaires postérieures indépendantes les unes par rapport aux autres et aux impulsions médicamenteuses externes peut être analysée. Pour confirmer l’entraînement, on peut par exemple déterminer la période des oscillations de signalisation endogène à l’aide du programme basé sur Python pyBOAT.
Lors de l’application d’impulsions avec une période de 130 minutes, les oscillations de signalisation d’encoche indiquent également une période de 130 minutes. Il est essentiel d’empêcher l’évaporation du liquide pendant l’expérience microfluidique. Sinon, des bulles d’air se formeront dans la puce qui interféreront avec le flux moyen.
Pour éviter cela, dégazez le milieu et la puce et assurez-vous que l’humidité dans l’incubateur est suffisamment élevée. En utilisant cette méthode, la dynamique de signalisation peut être modulée et leurs effets peuvent être analysés par imagerie en temps réel de rapporteurs fluorescents, d’immunocolorations ou d’hybridation in situ. En outre, le tissu peut également être extrait de la puce pour une analyse plus approfondie.
On peut utiliser cette méthode pour étudier la fonction de signalisation des oscillations dans le développement embryonnaire. Il a été appliqué pour démontrer l’importance du déphasage entre deux voies de signalisation oscillantes pour la segmentation de l’embryon de souris. Plus généralement, il peut maintenant être utilisé pour disséquer le mécanisme de codage de la signalisation dynamique dans les systèmes multicellulaires.
