La tomographie par rayons X Cryo Soft peut fournir des informations quantitatives précieuses au niveau cellulaire qui peuvent être utilisées de manière autonome ou en conjonction avec d’autres techniques d’imagerie. Image du capteur dans un état hydraté congelé qui ont besoin de coloration ou de sectionnement. De plus, il s’agit d’une technique à haut débit, car chaque tomogramme est collecté en quelques minutes seulement.
La cryotomographie à rayons X souples offre une plate-forme parfaite pour suivre le processus de restauration cellulaire dans les cellules infectées ou défectueuses au niveau de la cellule unique. Cette technique peut rapporter l’efficacité de nouveaux médicaments antiviraux ou de thérapie génique pour inverser l’infection des phénotypes expurgés. Pour charger des échantillons dans le microscope à rayons X à transmission, refroidissez la chambre de transfert avec de l’azote liquide jusqu’à ce qu’elle atteigne moins de 100 Kelvin.
Remplissez le poste de travail avec de l’azote liquide supplémentaire et allumez le chauffage du bord du poste de travail. Lorsque le bord du poste de travail cesse d’ébullition, placez la boîte cryo contenant des grilles aux endroits appropriés du poste de travail dans des conditions cryogéniques et chargez les grilles sur les porte-échantillons préalablement refroidis. Chargez les supports sur la navette et protégez-les avec les housses.
Chargez la navette dans la chambre de transfert à moins de 100 Kelvin et pompez la chambre jusqu’à un vide faible. Fixez la chambre de transfert au microscope et suivez la procédure de vide sur l’écran pour charger la navette de la chambre de transfert dans le microscope. Une fois que la navette est dans le microscope avec les échantillons, utilisez le bras du robot de microscope pour transférer un porte-échantillon à l’étape de l’échantillon.
Pour l’imagerie en champ clair de la grille avec le microscope à lumière visible en ligne, sélectionnez la caméra du microscope à lumière visible et allumez la source LED du microscope à lumière visible pour l’imagerie en champ clair. Cliquez sur Motion, Control, Sample et Sample theta pour faire pivoter l’échantillon à moins 60 degrés afin qu’il fasse face à l’objectif du microscope à lumière visible, puis sélectionnez Motion Control et Sample et modifiez l’échantillon X et l’échantillon Y pour déplacer l’échantillon vers les positions centrées attendues. Sélectionnez Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Modes d’acquisition, Continu et Démarrer, puis cliquez sur Contrôle de mouvement et échantillon pour sélectionner l’échantillon Z afin d’affiner la mise au point avec des étapes plus petites jusqu’à cinq microns jusqu’à ce que les cellules et/ou les trous du film de support en carbone soient mis au point.
Sélectionnez ensuite Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Modes d’acquisition, Mosaïque et Démarrer pour démarrer l’acquisition d’une carte mosaïque complète de la grille en mode champ clair à l’aide des valeurs par défaut de la mosaïque. Pour l’imagerie mosaïque en mode fluorescence, éteignez la source LED du microscope à lumière visible pour l’imagerie en champ clair et sélectionnez manuellement la source lumineuse LED correspondant à la longueur d’onde d’excitation souhaitée et le filtre optique correspondant sur la configuration. Sélectionnez Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Modes d’acquisition, Continu et Démarrer, puis cliquez sur Contrôle de mouvement et échantillon pour sélectionner l’échantillon Z afin d’affiner la mise au point sur l’image de fluorescence.
Ensuite, cliquez sur Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Modes d’acquisition, Mosaïque et Démarrer pour acquérir une carte mosaïque conservant les paramètres de position X et Y de la mosaïque en champ clair. Ensuite, éteignez la source de lumière LED. Pour l’acquisition de mosaïques de rayons X, changez la fente de sortie à cinq microns et utilisez une exposition d’une seconde à MISTRAL.
Sélectionnez Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Paramètres de l’appareil photo et Binning pour ajuster la mise au point à l’aide de la traduction Z de l’exemple. Sélectionnez Contrôle de mouvement et échantillon pour sélectionner l’échantillon Z.En commençant par étapes de cinq microns, affinez la mise au point jusqu’à des étapes de 0,5 micron jusqu’à ce que la cellule ou les trous de feuille de carbone soient bien mis au point. Pour acquérir une carte mosaïque du carré de maillage, cliquez sur Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Mode d’acquisition, Mosaïque et Démarrer.
Une fois la carte acquise, cliquez sur Contrôle de mouvement et Exemple et modifiez l’échantillon X et l’échantillon Y pour déplacer l’échantillon vers une position de champ plat. Réglez le temps d’exposition à une seconde à MISTRAL. Ensuite, normalisez la mosaïque acquise par l’image de champ plat pour obtenir la transmission et enregistrer la mosaïque normalisée.
Pour aligner l’échantillon sur l’axe de rotation avec la rotation à zéro degré, sélectionnez Contrôle de mouvement et Échantillon et modifiez l’échantillon X, l’échantillon Y et l’échantillon Z pour vous concentrer sur la caractéristique de la cellule à placer sur l’axe de rotation. Pour faire pivoter l’échantillon vers une position thêta positive, sélectionnez Contrôle de mouvement et Échantillon et remplacez Échantillon thêta par thêta positif. Utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur la fonction de la cellule à placer sur l’axe de rotation.
Pour faire pivoter l’échantillon vers une position thêta négative, sélectionnez Contrôle de mouvement et Échantillon et remplacez l’échantillon thêta par thêta négatif. Utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur la fonction de la cellule à placer sur l’axe de rotation. En position thêta positive ou négative, utilisez la translation Z de l’échantillon pour déplacer la fonction sélectionnée vers la position centrale entre les deux lignes et répétez la rotation de l’échantillon jusqu’à ce qu’une distance minimale ligne à ligne soit obtenue.
Lorsque le thêta de l’échantillon est égal à zéro, déplacez l’échantillon X deux fois la distance nécessaire pour placer la fonction sélectionnée au centre du champ de vision et déplacez la plaque de zone X pour ramener la fonction au centre du champ de vision. Pour réoptimiser la position Z de la plaque de zone par rapport au nouvel axe de rotation, sélectionnez Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Modes d’acquisition et Série focale, puis cliquez sur Démarrer pour enregistrer une série focale Z de plaque de zone. Ensuite, cliquez sur Contrôle de mouvement et Plaque de zone et sélectionnez la plaque de zone Z pour déplacer la plaque de zone Z à la position à laquelle l’échantillon est au point.
Pour acquérir un tomogramme, cliquez sur Contrôle de mouvement et échantillon et sélectionnez Échantillon thêta pour déplacer l’angle maximal négatif à plus 0,1. Cliquez sur Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Modes d’acquisition et Tomographie pour définir le nombre d’images comme nombre total d’angles, en tenant compte de l’image à l’angle zéro et de la plage angulaire, et définissez le nombre d’images. Sélectionnez Début de l’angle et Fin de l’angle, cliquez sur Microscope, Acquisition, Paramètres d’acquisition, Paramètres de l’appareil photo et définissez le temps d’exposition.
Cliquez sur Démarrer pour lancer l’acquisition de la série d’inclinaison de la tomographie. L’échantillon idéal devrait avoir des cellules uniques au centre d’un maillage carré incrusté dans une fine couche de glace et entouré de marqueurs fiduciaux dorés bien dispersés. De nombreux organites différents, tels que les mitochondries, les réticulas endoplasmiques, les vacuoles et le noyau devraient pouvoir être distingués dans le tomogramme final reconstruit, grâce à la reconstruction quantitative des coefficients d’absorption linéaires.
Dans cette image, un carré avec une densité cellulaire plus élevée peut être observé. Dans cet exemple, le buvard était moins efficace, ce qui entraînait une couche de glace plus épaisse avec des fissures. Même si certaines structures plus grandes peuvent être reconnues dans cette préparation, des détails fins ont été perdus dans le bruit et la texture granuleuse en raison de la mauvaise qualité de vitrification de la glace épaisse.
L’échantillon cryoconservé doit être manipulé de manière minimale, car la plupart des artefacts sont induits lorsque les échantillons sont à ce stade. Habituellement, la photomicroscopie corrélative cryo-lumière visible, vous utilisez une tomographie avant cryo-substrat. En outre, la microscopie spectrale peut être effectuée sur les éléments chimiques pertinents.
Ce protocole remplit une niche en opérant dans un spécimen et un régime de résolution, qui ne sont facilement accessibles par aucune autre technique d’imagerie directe, permettant quelques microns et une résolution de demi-hauteur de 30 nanomètres.
