Notre compréhension de la morphogenèse oculaire provient d’études antérieures sur les tissus fixes. Cependant, ces études manquaient de dynamique cellulaire et tissulaire. Grâce à l’imagerie time-lapse, nous sommes en mesure de capturer l’ensemble de ce processus à des fins de visualisation et d’analyse.
Notre méthode qui tire parti du développement externe de la clarté optique des embryons de poisson-zèbre, qui facilite l’imagerie en direct, et utilise la microscopie confocale à balayage laser qui est facilement disponible sur la plupart des campus de recherche. Les chercheurs qui débutent dans cette méthode devraient s’attendre à des essais et des erreurs avant d’obtenir un ensemble de données utilisable. De nombreuses étapes, en particulier les injections et l’intégration, doivent bien se passer pour réussir, alors ayez de la patience.
Une fois que le poisson-zèbre commence à se reproduire, en attendant 15 à 20 minutes pour s’assurer que les œufs sont fécondés, utilisez une pipette P10 et des pointes de microlitre P10 pour recharger une aiguille de micro-injection capillaire en verre tirée avec 2,5 à 5 microlitres de la dilution d’ARN d’intérêt. Lorsque les œufs sont prêts, utilisez une pipette de transfert et un microscope à dissection pour charger soigneusement les œufs dans le moule d’injection, en utilisant une pince pour rouler les embryons de manière à ce que la cellule unique soit visible si nécessaire. Ensuite, injectez tous les embryons au stade d’une cellule, en ciblant la cellule et non le jaune pour assurer un étiquetage uniforme de l’embryon en développement.
Environ 11 heures après la fécondation, placez une aliquote d’un à cinq millilitres d’agarose fondue de 1,6% dans un milieu E3 dans un bloc thermique de 42 degrés Celsius et utilisez un microscope à fluorescence pour dépister les embryons injectés avec succès avec une luminosité globale de florescence. Comptez les somites pour mettre correctement en scène les embryons. 11 heures après la fécondation, trois somites doivent être observées.
Un échantillon idéal aura de forts signaux EGFP et mCherry et sera au bon stade de développement. Avant le montage, placez les embryons dans un plat enrobé d’agar et utilisez une pince pour retirer le chorion de chaque embryon. Lorsque tous les embryons ont été dénudés, utilisez une pipette à rouleaux en verre pour aspirer un embryon.
Éjectez autant d’E3 que possible pour que l’embryon se trouve à l’extrémité de la pipette Pasteur en verre et déposez l’embryon dans le tube d’agarose du bloc thermique. Laissez les embryons s’enfoncer dans l’agarose pendant quelques secondes avant d’aspirer un petit volume d’agarose avec l’embryon, en faisant attention à ce que l’embryon reste à l’extrémité de la pipette. Éjectez l’embryon et l’agarose dans une gouttelette d’agarose dans un plat à fond de verre et utilisez rapidement mais soigneusement une pince pour orienter la face dorsale de l’embryon vers le bas avant que la gouttelette d’agarose ne durcisse.
Après avoir monté 10 à 12 embryons de la même manière, ajoutez suffisamment d’agarose pour recouvrir complètement le fond du plat en envelont toutes les gouttelettes dans un seul disque d’agarose. Lorsque l’agarose a durci, superposez E3 sur l’agarose pour garder les échantillons hydratés. Après avoir défini le microscope confocal à balayage laser sur les paramètres appropriés pour l’imagerie time-lapse, recouvrir généreusement le dessous de la parabole inférieure en verre d’un milieu d’immersion correspondant à l’indice de réfraction de l’eau, en prenant soin d’éviter les bulles d’air, et appliquer une petite goutte de milieu d’immersion sur l’objectif d’eau 40X.
Fixez le fond en verre dans l’insert de scène et ajoutez un milieu E3 supplémentaire pour garder les embryons humides pendant la nuit. Utilisez de la pâte à modeler pour sceller le couvercle en plastique sur le plat et élever l’objectif pour entrer en contact avec le plat. Sous l’en-tête positions du logiciel de microscope, cliquez sur Ajouter pour enregistrer les informations XYZ du premier échantillon à faire l’objet d’un laps de temps et sélectionner un échantillon avec une forte fluorescence et un montage optimal.
Sous l’onglet Localiser, recherchez l’exemple suivant, puis cliquez sur Position et ajoutez pour sélectionner l’échantillon comme illustré. Lorsque tous les échantillons ont été sélectionnés, mettez en surbrillance la première position et cliquez sur Déplacer vers. Tout en scannant en continu, alignez la vésicule optique dans le cadre, en laissant suffisamment d’espace dans les régions antérieure et distale par rapport à la vésicule optique et au cerveau.
Pour attribuer la première et la dernière tranche Z, sélectionnez définir en premier et définir en dernier tout en vous déplaçant dans la direction Z avec le bouton de mise au point fine, en maintenant un nombre total de tranches d’environ 63 pour tenir compte de la croissance de la coupe optique. Inclure de l’espace supplémentaire sur la face ventrale de la vésicule optique pour permettre la croissance. Une fois que la première et la dernière tranche Z ont été définies, cliquez sur C pour vous déplacer vers le centre de la pile Z et ajuster la puissance et le gain laser pour les deux lasers.
Lorsque la puissance et le gain du laser ont été définis, arrêtez le balayage et cliquez sur Mettre à jour pour mettre à jour les informations de position. Pour passer à la position suivante, cliquez sur la position deux. Une fois que la première et la dernière tranche Z ont été définies comme illustré, ouvrez l’en-tête de la série chronologique et définissez le nombre de cycles sur 300 et l’intervalle de temps sur 2,5 minutes.
Après avoir examiné les paramètres pour vous assurer que tout est finalisé, cliquez sur Démarrer pour commencer le time-lapse et confirmer que le premier tour d’imagerie est capturé correctement avant de permettre au time-lapse de s’exécuter pendant la nuit. L’injection directe dans la cellule unique est nécessaire pour un marquage uniforme et une fluorescence robuste. Lors de leur immersion dans l’agarose, les embryons doivent être espacés uniformément dans tout le plat.
Si les embryons sont mis en scène correctement, suffisamment fluorescents et correctement montés, ils resteront dans le cadre d’imagerie pendant le time-lapse, ce qui permettra d’imager l’organe entier. Les échantillons qui ne sont pas orientés le long de l’axe dorsal, tels que ceux qui sont horizontaux ou diagonals, sortiront du cadre d’imagerie au fur et à mesure que le time-lapse avance et ne pourront pas être utilisés pour une analyse plus approfondie. Un embryon qui est sur-tourné entraînera un time-lapse plus postérieur.
Un embryon sous-tourné ne permettra d’observer que le tissu le plus antérieur. De plus, les échantillons montés par rapport à l’orientation de la trame sont plus susceptibles de produire un time-lapse réussi. Ce biais vers le côté ventral fournit un espace supplémentaire pour la croissance tissulaire dans la direction ventrale, ce qui se traduit par un time-lapse optimal.
Lorsque ces critères ne sont pas remplis, le time-lapse ne capturera plus tout le volume 3D du tissu au fur et à mesure de son développement et ne pourra plus être utilisé pour une analyse plus approfondie. Ces ensembles de données riches en informations peuvent être analysés de nombreuses façons, y compris le suivi cellulaire 4D avec des quantifications de la vitesse et de la trajectoire des cellules, des mesures du volume cellulaire et tissulaire et des visualisations 3 et 4D.
