Ici, nous démontrons la méthode Updegraff, la méthode la plus largement utilisée au monde pour l’estimation de la teneur en cellulose cristalline. La cellulose est essentiellement composée de monomères de glucose liés par beta-1, 4 liaisons glycosidiques. Nous avons divisé ce protocole en cinq phases.
Dans la première phase, nous préparons le matériau de biomasse végétale. Dans la deuxième phase, nous extrayons la paroi cellulaire brute. Dans la troisième phase, nous utilisons le traitement Updegraff dans lequel Updegraff est composé d’acide acétique et d’acide nitrique qui aide à l’élimination de l’hémicellulose et de la lignine de nos échantillons.
Dans la quatrième phase, nous le soumettons à l’hydrolyse acide à l’aide d’acide sulfurique qui produit les monomères de glucose. Enfin, dans la cinquième phase, nous utilisons un test anthrone pour estimer la teneur en cellulose cristalline. Recueillir le matériel végétal de la serre, les laver soigneusement avec de l’eau, sécher à l’air pendant deux jours, séparer le tissu et transférer le tissu dans les contenants étiquetés individuellement et les incuber dans l’incubateur à 49 degrés Centigrade pendant 10 jours.
Puis enfin, couper en morceaux à l’aide de ciseaux ou de lame. Congeler le tissu et le charger dans le mortier et le pilon pour le broyage fin en poudre uniforme ou utiliser alternativement congélateur / moulin. Ici, nous démontrons à l’aide de congélateur/moulin, donc nous chargeons nos échantillons de tissus dans ces flacons de broyage et les placeons dans le congélateur/moulin et utilisons la vitesse de 10 CP pendant trois cycles.
La poudre de tissu est recueillie dans le tube falcon comme indiqué ici. Peser 20 mg de la poudre de tissu et transférer dans un tube pré-pesé de deux mL. Ajouter un mL de tampon de solubilisation des protéines pour éliminer les protéines. tourbillon.
Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter le surnatant. Répétez cette étape deux fois de plus.
Ajouter un mL d’eau stérile à la pastille retenue. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Répétez cette étape deux fois de plus.
Ajouter une ML de 70 % d’éthanol à la pastille retenue. tourbillon. Transférer dans un bloc centigrade préchauffé de 70 degrés avec secousse simultanée pendant une heure. Après une heure d’incubation, centrifugeuse à 15 000 RPM pendant cinq minutes.
Répétez cette étape une fois de plus. À la pastille économisée, ajouter un mL de 100% méthylone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes.
Ajouter un mL de méthanol chloroforme. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter le supernatant et ajouter un mL d’acétone. tourbillon.
Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Re-jeter le supernatant et l’air les sécher à 37 degrés Centigrade pendant la nuit ou continuer par séchage sous vide.
Chargez vos échantillons dans le séchoir à vide et séchez l’air pendant deux à trois heures ou jusqu’à ce que la pastille soit complètement sèche. Pesez cinq mg de l’extrait de la paroi cellulaire obtenu à partir de l’étape précédente. Transférer dans un tube de bouchon à vis de deux mL.
Incluez également un contrôle positif à ce stade. Utilisez deux mg de papier filtre Whatman à cette fin. Transférer dans un tube à bouchon à vis de deux mL.
Ajouter 1,5 mL de réagencé Updegraff à chaque extrait de paroi cellulaire pesée. Vortex et incuber à 100 degrés Centigrade dans un bloc préchauffé pendant 30 minutes. Après 30 minutes d’incubation, transférer sur une grille.
Laissez refroidir sur le banc pendant 10 minutes. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 10 minutes. Jeter le surnatant sans déranger la pastille.
Ajouter un mL d’eau stérile. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 10 minutes. Jeter 500 microlitres du supernatant.
Ajouter un mL d’acétone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter un mL du surnatant.
Ajouter un mL d’acétone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jetez complètement le surnatant.
Ajouter un mL d’acétone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter le surnatant.
Sec à 37 degrés Centigrades durant la nuit. Après une incubation d’une nuit, transférer sur une grille. Ajouter un mL d’acide sulfurique à 67 %. tourbillon.
Incuber à 25 degrés Centigrades pendant une heure avec secousses simultanées. Après une heure d’incubation, assurez-vous que la pastille est complètement dissoute. Transférer sur une grille.
C’est la dernière étape de l’extraction de la cellulose. Maintenant, les échantillons sont prêts pour la dilution de l’échantillon. Pour la dilution de l’échantillon, utilisez 10 microlitres de chaque échantillon de l’étape précédente et ajoutez 490 microlitres d’eau stérile.
Répétez cette demande pour tous les échantillons expérimentaux. Pour la préparation de courbe standard de glucose, préparez un stock frais d’un mg par mL de glucose et préparez zéro microgramme à 200 concentrations de microgrammes en ajoutant un mg par glucose mL en 20 incréments de microlitre et faites le volume final à un mL avec de l’eau stérile. Prenez 500 microlitres de chaque norme préparée dans un tube de bouchon à vis et ajoutez un mL 0,2% anthrone.
Et maintenant, les échantillons sont prêts pour un essai anthrone. Ajouter un mL d’anthrone fraîchement préparé. Mélanger immédiatement par vortex et transférer sur la glace.
Répétez pour toutes les normes et les échantillons de la même manière. Puis transférer à un bloc préchauffé 100 degrés Centigrade pendant 10 minutes. Après 10 minutes d’incubation, transférer sur la glace et incuber pendant cinq minutes sur la glace.
Après l’incubation, prendre 200 microlitres de chaque échantillon en trois répliques. Répétez l’essai pour les normes et les échantillons de la même manière. Et une plaque chargée de 96 puits a été chargée dans un détecteur multimode.
En utilisant le programme Smart Max Pro, nous avons réglé le réglage du filtre à 620 nanomètres. Type de plaque à 96-bien type. Sélectionnez toute la zone de lecture.
Cliquez sur OK. lire. Lisez la plaque. Vous obtenez les lectures d’absorption des normes et des échantillons, qui seront collectés dans la feuille Excel pour une analyse et une estimation plus approfondies de la teneur en cellulose.
La courbe standard de glucose est préparée en utilisant les concentrations de glucose dans les microgrammes par mL sur x-axe et les valeurs normalisées d’absorption de la concentration respective à 620 nanomètres sur l’axe y. Nous obtenons la ligne de régression avec des valeurs m et c dans le graphique de dispersion tracé que nous utilisons pour estimer la teneur en cellulose cristalline de l’échantillon. Dans la première étape, nous avons fait la moyenne des valeurs d’OD à 620 nanomètres.
Et puis nous avons normalisé les données en soustrayant la valeur vierge. Nous calculons la concentration de glucose en utilisant la formule x est égale à OD moins c/m où nous branchons les valeurs c et m de l’étape précédente de la ligne de régression dans la courbe standard. Puisque le volume total qui a été employé pour l’essai d’anthrone est 500 microlitres, nous le divisons par le facteur de dilution deux.
Puisque le volume d’échantillon qui a été employé était seulement 10 microlitres, nous diviserons encore par 10 pour obtenir des microgrammes par concentration de microlitre de glucose qui est égale à mg par concentration de mL. Et puis nous avons utilisé le facteur d’humidité 1.11 qui est le gain d’humidité dans le processus. Et enfin, nous calculons la teneur en cellulose cristalline pour cent en la divisant avec le poids de la paroi cellulaire, qui est proche de cinq mg, et se multiplient par 100 pour obtenir le pour cent.
Ensuite, nous avons fait la moyenne de la teneur en cellulose cristalline de trois répliques biologiques pour obtenir la valeur pour les échantillons individuels, qui seront comparés à une autre moyenne de ligne expérimentale de trois répliques biologiques. Et t-test peut être utilisé pour tester leur niveau de signification. Ici, dans le tableau A, nous montrons les valeurs de table de la concentration et de l’OD respectif à 620 nanomètres, qui a été utilisé pour tracer un graphique de dispersion et une ligne de régression avec les valeurs m et c qui ont été utilisées dans le C pour obtenir les différences de contenu de cellulose entre les deux lignées expérimentales.
En conclusion, les deux échantillons montrent des différences de cellulose. Merci d’avoir regardé.
