Cette méthode utilise les différentes manières de s’attaquer aux défis d’expression des protéines virales recombinantes en utilisant une protéine virale P’as chaperon pour une autre protéine virale N’pour obtenir des protéines N sans ARN. La protéine RSV N sans ARN est obtenue avant l’assemblage de l’ARN spécifique du virus en nucléopside in vitro. La méthode peut également être utilisée avec d’autres virus à ARN sensoriel négatif non segmentés.
La méthode de clonage indépendante de la ligature est une technique rapide pour acquérir des constructions de co-expression. Pourquoi ou électifs microscope électronique de coloration est une méthode rapide pour vérifier grand assemblage dans la cellule brute. Nous voulons vous donner deux conseils.
Tout d’abord, obtenez un rendement élevé et des résultats solides pour chaque étape avant de passer à l’étape suivante. Deuxièmement, cherchez des programmes appropriés pour la chromatographie et entraînez-vous à ramasser des grilles avec des pinces. Pour la construction bi-cistronique de la co-expression N et P, cultiver quatre cultures d’un litre de cellules de souche E coli BL21DE3 dans un milieu LB à 37 degrés Celsius.
Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,6, abaissez la température à 16 degrés Celsius. Après une heure, induisez l’expression des protéines par traitement avec 0,5 millimolaire IPTG pendant la nuit. Le lendemain matin, prélever les cellules par centrifugation et ressusciter les pastilles dans 200 millilitres de tampon de lyse.
lyser les cellules par sonication pendant 15 minutes, avec trois secondes sur, trois secondes sur les impulsions. Et recueillir les lysats par centrifugation. Chargez le surnageant dans une colonne gravitaire de cobalt de 2,5 par 10 centimètres, avec environ 10 millilitres de perles.
Pré-équilibré avec 5 à 10 volumes de colonne de tampon de lyse. Et lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon B et cinq volumes de tampon C.Utilisez deux volumes de tampon D pour éluer la protéine des perles. Et équilibrer la colonne Q avec cinq volumes d’un millilitre de tampon QA.
Utilisez une pompe péristaltique pour charger l’échantillon dilué sur la colonne. Faites fondre la colonne Q chargée sur la machine HPLC, ainsi que de nouveaux tampons QA et QB. Exécutez le lavage de la pompe pour laver avec succès la machine avec un à deux volumes de tampons QB et QA.
Après le dernier lavage, réglez le débit à un millilitre par minute et réglez UV1 à 280 nanomètres et UV2 à 260 nanomètres, en utilisant une plaque de puits profonde de 96 pour collecter les fractions. Ensuite, utilisez une application de gradient par étapes de trois à quatre volumes de chaque concentration d’agent d’élution pour éluer les protéines, en commençant à une concentration de QB de 0% et en augmentant le pourcentage de 5% à chaque fois. Le complexe protéique N-0 P éluera à la concentration tampon de 15% QB.
Isoler la protéine par filtration sur gel, dans une colonne de purification à petite échelle d’un par 30 centimètres, équilibrée avec le tampon E.Puis analyser les fractions contenant des protéines par page SDS. Pour l’assemblage nucléopside spécifique au virus, mélanger et incuber le complexe N-0 P purifié avec un oligo-ARN à un rapport moléculaire de 1:1,5 à température ambiante pendant une heure. Pré-équilibrer une colonne de filtration de gel de purification à petite échelle avec le tampon E.Et éliminer toute précipitation par centrifugation.
Chargez le surnageant, à la colonne de chromatographie d’exclusion de taille. Et comparez les images de chromatographie d’exclusion de taille de la protéine à l’assemblage ARN, et les échantillons de contrôle de protéine seule, en combinant les rapports de pureté des acides nucléiques, pour identifier quels pics sont l’ARN N assemblé, N-0 P et l’ARN libre. Pour assembler un complexe d’ARN N, collectez toutes les fractions de crête de l’ARN N, effectuez une extraction de l’ARN et exécutez un gel de page d’urée pour vérifier la longueur de l’ARN spécifique.
Pour préparer une grille de coloration négative pour la microscopie électronique à coloration négative, utilisez une plaque chauffante pour chauffer 5 mL d’eau double distillée à ébullition et ajoutez 37,5 milligrammes de formate d’uranyle à l’eau pour obtenir une solution de coloration au formate d’uranyle à 0,75%. Transférer la solution dans un bécher recouvert de papier d’aluminium. Et ajoutez quatre microlitres d’hydroxyde de sodium 10 molaires.
Après 15 minutes d’agitation à l’abri de la lumière, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 micron dans un tube à essai. Pour rendre les grilles de microscopie électronique à revêtement continu de carbone hydrophiles, placez les grilles dans une chambre connectée à une alimentation électrique et appliquez des ions chargés négativement sur les grilles. Coupez et pliez une bande de parafilm de deux par deux pouces.
Ajouter deux gouttes d’eau distillée de 40 microlitres à une extrémité de la bande. Et deux gouttes de 40 microlitres de solution de coloration à 0,75% uranyl formate à l’autre extrémité. Ajouter trois microlitres d’échantillon de protéines à chaque grille.
Après une minute, bloquez les grilles contre le papier buvard et trempez les grilles deux fois dans les gouttelettes d’eau distillée. Et une fois dans la première gouttelette de solution de coloration. Ensuite, plongez la grille dans la deuxième gouttelette de solution de coloration pendant 30 secondes, avant de éponger les grilles contre le papier buvard pour éliminer tout excès de solution de coloration et permettre aux grilles de sécher à l’air avant l’imagerie.
Utilisant ce protocole, un complexe syncytial soluble de virus N0 P de virus respiratoire dimeric soluble à grande échelle peut être obtenu. Dans E coli, toute la longueur des portions N et N-terminales des protéines P est co-exprimée avec une étiquette 10 X His sur la protéine N. Basé sur le rapport de pureté d’acide nucléique d’absorbance UV, N0 P a contenu la pleine longueur N et le N-terminal P, mais n’a pas contenu l’ARN cellulaire.
Le N0 P purifié pourrait alors être stimulé et assemblé en nucléospides comme des particules sur des grilles de microscopie électronique via l’incubation avec des oligos d’ARN spécifiques comme démontré. Lors de la purification de la protéine, évitez les bulles d’air pendant la purification de la colonne et diluez l’échantillon avec un tampon QA pour ajuster le pH et la concentration en sel avant de charger l’échantillon sur la colonne. Prenez soin de maintenir les grilles de microscopie électronique sur le bord extérieur pour éviter de contaminer les grilles.
Cela nous aidera à déterminer les questions non positives d’emballage du génome du RSV, qu’il s’agisse d’une structure hélicoïdale gaucher ou droitière. En suivant ces procédures et authentiquement, un modèle d’ARN pour le test d’activité de la polymérase RSV peut être effectué. Et cette nucléopside virale spécifique au RSV peut être utilisée pour l’analyse cryo EM haute résolution.
