Cette étude présente un protocole pour la différenciation des cellules précurseurs neuronales uniquement induites par la stimulation directe du courant pulsé dans un système microfluidique. Cette technique fournit une approche bénéfique pour réduire le temps d’installation expérimentale, le volume de l’échantillon et le volume des réaccents. De plus, la puce MOE convient aux observations de microscopie confoccale.
Le traitement à courant direct simple peut contrôler le sort des cellules précurseurs neuronales de la souris et pourrait être utilisé pour développer des stratégies thérapeutiques pour les troubles du système nerveux. Pour commencer, dessiner des motifs pour les différentes couches PMMA et le ruban à double face à l’aide d’un logiciel approprié. Allumez le scriber laser au dioxyde de carbone et connectez-le à un ordinateur personnel.
Ouvrez le fichier de motifs conçu à l’aide du logiciel. Placez les feuilles PMMA ou le ruban adhésif à double face sur la plate-forme du scriber laser, puis concentrez le laser sur la surface des feuilles PMMA ou sur le ruban à double face à l’aide de l’outil de mise au point automatique. Sélectionnez le scriber laser comme imprimante, puis utilisez le scriber laser pour démarrer l’ablation directe sur la feuille PMMA ou le ruban adhésif à double face.
Retirer le film protecteur des feuilles pmma et nettoyer la surface à l’aide de gaz azoté. Pour lier plusieurs couches de feuilles PMMA, empilez trois morceaux de feuilles PMMA d’un millimètre et les lier sous une pression de cinq kilogrammes par centimètre carré dans un obligataire thermique pendant 30 minutes à 110 degrés Celsius pour former l’assemblage du canal de stimulation électrique ou d’écoulement. Adhérez 12 pièces d’adaptateurs aux ouvertures individuelles dans la couche un de l’assemblage de puce de MOE avec la colle cyanoacrylate à action rapide.
Désinfectez les substrats PMMA d’un millimètre, le ruban adhésif à double face et le PMMA optique de trois millimètres à l’aide de l’irradiation ultraviolette pendant 30 minutes avant d’assembler la puce. Adhérez aux substrats PMMA d’un millimètre sur le PMMA optique de trois millimètres avec le ruban adhésif à double face pour compléter l’assemblage pmma. Adhérez à la couverture nettoyée à l’assemblage PMMA avec le ruban adhésif à double face.
Sceller les ouvertures des adaptateurs de pont d’agar avec des bouchons blancs serrés aux doigts. Connectez le connecteur à fond plat à l’assemblage de puces MOE via l’entrée moyenne et les adaptateurs de sortie, puis connectez l’adaptateur cone Luer aux robinets d’arrêt à trois sens. Ajoutez deux millilitres de solution 0,01% PLL à l’aide d’une seringue de trois millilitres qui se connecte au robinet d’arrêt à trois sens de l’entrée moyenne, et connectez une seringue vide de trois millilitres à la robinet d’arrêt à trois sens de la prise moyenne.
Remplissez les régions de culture cellulaire avec la solution PLL, et pompez lentement la solution de revêtement dans les deux sens. Fermez les deux robinets à trois pour sceller la solution à l’intérieur des régions de culture. Incuber la puce MOE à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans un incubateur rempli de 5% d’atmosphère de dioxyde de carbone.
Ouvrez les deux robinets d’arrêt à trois voies et chassez les bulles dans les canaux en pompant manuellement la solution de revêtement dans les deux sens dans le canal à l’aide des deux seringues. Dessinez trois millilitres de milieu complet dans une seringue de trois millilitres qui se connecte au robinet d’arrêt à trois sens de l’entrée moyenne et ajoutez-la pour remplacer la solution de revêtement dans les régions de culture cellulaire. Remplacez la prise blanche serrée au doigt par l’adaptateur Luer et injectez 3 % d’agarose chaude pour remplir l’adaptateur.
Connectez la seringue de verrouillage Luer à l’adaptateur Luer et injectez 3% d’agarose chaude à travers le bong en caoutchouc noir pour remplir la seringue de verrouillage Luer. Laisser refroidir et solidifier de 10 à 20 minutes l’agarose. Installez la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO transparent qui est fixé sur un stade motorisé XYZ programmable maintenu à 37 degrés Celsius.
Infuser les mNPC en pompant manuellement dans la puce MOE via la prise moyenne, puis incuber la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO pendant quatre heures. Utilisez des fils électriques pour connecter un multiplexeur EF à la puce MOE via les électrodes de la puce. Connectez un multiplexeur EF et un générateur de fonction à un amplificateur pour produire des impulsions DC à ondes carrées.
Retirez tous les connecteurs et adaptateurs à fond plat sur la puce MOE et remplissez les adaptateurs avec PBS, puis scellez les ouvertures de l’adaptateur avec du parafilm. Après immunostaining, observez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence confoccale. La stimulation d’impulsion de DC a eu comme conséquence les mNPCs simultanés différeciant dans les neurones, les astrocytes, et les oligodendrocytes dans le milieu d’entretien de cellules souches.
Les pourcentages de neurones, d’astrocytes et d’oligodendrocytes dans le groupe témoin et dans le groupe de stimulation sont montrés ici. Après le traitement d’impulsion de DC, les mNPCs ont exprimé des nombres sensiblement élevés de neurones à DIV sept, d’astrocytes à DIV trois, et d’oligodendrocytes au DIV sept et au DIV 14 étaient présents aux niveaux relativement plus élevés dans les groupes de stimulation que dans le groupe témoin. Les neurosphères formées par 30 à 40 cellules sont préférées pour initier la différenciation mNPC.
La prolifération des MNPC nuira à la survie cellulaire pendant le processus de différenciation.
