Este estudio presenta un protocolo para la diferenciación de las células precursoras neuronales inducidas únicamente por la estimulación directa del pulso de corriente en un sistema microfluídico. Esta técnica proporciona un enfoque beneficioso para reducir el tiempo de configuración experimental, el volumen de la muestra y el volumen de reactivos. Además, el chip MOE es adecuado para observaciones de microscopía confocal.
El tratamiento simple del pulso de corriente directa puede controlar el destino de las células precursoras neuronales del ratón y podría utilizarse para desarrollar estrategias terapéuticas para trastornos del sistema nervioso. Para empezar, dibuje patrones para capas PMMA individuales y la cinta de doble cara utilizando el software adecuado. Encienda el escribar láser de dióxido de carbono y conéctelo a un ordenador personal.
Abra el archivo de patrón diseñado utilizando el software. Coloque las hojas pmma o cinta de doble cara en la plataforma del escribar láser y, a continuación, centre el láser en la superficie de las hojas de PMMA o en la cinta de doble cara mediante la herramienta de enfoque automático. Seleccione el escribar láser como impresora y, a continuación, utilice el escribar láser para iniciar la ablación directa en la hoja PMMA o cinta a doble cara.
Retire la película protectora de las láminas de PMMA y limpie la superficie con gas nitrógeno. Para unir múltiples capas de láminas de PMMA, apile tres piezas de láminas de PMMA de un milímetro y acompájelas bajo una presión de cinco kilogramos por centímetro cuadrado en una unión térmica durante 30 minutos a 110 grados Celsius para formar el flujo o el conjunto del canal de estimulación eléctrica. Adherir 12 piezas de adaptadores a las aberturas individuales en la capa uno del conjunto de chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida.
Desinfectar los sustratos pmma de un milímetro, la cinta de doble cara y el PMMA de grado óptico de tres milímetros usando irradiación ultravioleta durante 30 minutos antes de montar el chip. Adhera los sustratos PMMA de un milímetro en el PMMA de grado óptico de tres milímetros con la cinta de doble cara para completar el ensamblaje de PMMA. Adhiera el vidrio de cubierta limpiado al conjunto PMMA con la cinta de doble cara.
Selle las aberturas de los adaptadores del puente del agar con tapones blancos ajustados a los dedos. Conecte el conector inferior plano al conjunto de chips MOE a través de los adaptadores de entrada y salida medianas y, a continuación, conecte el adaptador Cono Luer a los stopcocks de tres vías. Añadir dos mililitros de solución 0.01% PLL utilizando una jeringa de tres mililitros que se conecta al stopcock de tres vías de la entrada mediana, y conectar una jeringa vacía de tres mililitros al tapón de tres vías de la toma de corriente media.
Llene las regiones de cultivo celular con la solución PLL y bombee lentamente la solución de recubrimiento de un lado a otro. Cierre los dos stopcocks de tres vías para sellar la solución dentro de las regiones de cultivo. Incubar el chip MOE a 37 grados Celsius durante la noche en una incubadora llena de 5% de la atmósfera de dióxido de carbono.
Abra los dos stopcocks de tres vías y tire las burbujas en los canales bombeando manualmente la solución de recubrimiento de ida y vuelta en el canal utilizando las dos jeringas. Dibuje tres mililitros de medio completo en una jeringa de tres mililitros que se conecte al stopcock de tres vías de la entrada mediana y agréguelo para reemplazar la solución de recubrimiento en las regiones de cultivo celular. Reemplace el tapón blanco ajustado con el adaptador Luer e inyecte 3% de agarose caliente para llenar el adaptador.
Conecte la jeringa de bloqueo Luer al adaptador Luer e inyecte 3% de agarose caliente a través del bong de goma negro para llenar la jeringa de bloqueo Luer. Espere de 10 a 20 minutos para que la agarose se enfríe y se solidifique. Instale el chip MOE de semillas celulares en el calentador ITO transparente que se fija en una etapa motorizada XYZ programable mantenida a 37 grados Celsius.
Infunda los mNPC bombeando manualmente al chip MOE a través de la toma de corriente media, luego incuba el chip MOE de semillas celulares en el calentador ITO durante cuatro horas. Utilice cables eléctricos para conectar un multiplexador EF al chip MOE a través de los electrodos del chip. Conecte un multiplexador EF y un generador de funciones a un amplificador para emitir pulsos de CC de onda cuadrada.
Retire todo el conector y adaptadores de fondo plano del chip MOE y llene los adaptadores con PBS y, a continuación, selle las aberturas del adaptador con parafilm. Después de la inmunodetención, observe las células utilizando un microscopio de fluorescencia confocal. La estimulación del pulso de CC dio lugar a mNC simultáneos que se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en el medio de mantenimiento de células madre.
Los porcentajes de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en el grupo de control y en el grupo de estimulación se muestran aquí. Después del tratamiento del pulso de CC, los MNC expresaron un número significativamente alto de neuronas en DIV siete, astrocitos en DIV tres y oligodendrocitos en DIV siete y DIV 14 estaban presentes en niveles relativamente más altos en los grupos de estimulación que en el grupo de control. Neuroesferas formadas por 30 a 40 células son preferidas para iniciar la diferenciación mNPC.
El crecimiento excesivo de mNPC afectará la supervivencia celular durante el proceso de diferenciación.
