Ce protocole décrit les techniques qui peuvent être utilisées par les physiologistes des petits animaux pour élucider le rôle des neuropeptides et d’autres facteurs hormonaux qui régulent le système digestif et / ou excréteur. Ces techniques permettent de mesurer des échantillons biologiques de taille microscopique qui, autrement, ne seraient pas possibles à l’aide de techniques conçues spécifiquement pour des modèles animaux plus grands, y compris, par exemple, les rongeurs et les téléus. Cette méthode peut fournir un aperçu de la régulation endocrinienne de l’intestin, y compris le transport de l’épithélium, ainsi que des muscles lisses associés au tractus gastro-intestinal chez les insectes et chez les espèces non insectes de taille similaire.
Farwa Sajadi, une candidate au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures tubales rénales des insectes. De plus, un ancien étudiant diplômé de mon laboratoire Aryan Lajevardi fera la démonstration des protocoles axés sur l’intestin postérieur. Commencez par préparer les plats ramsay et les tests de contraction pour les expériences.
Utilisez une pipette et remplissez les puits avec jusqu’à 20 microlitres de solution. Pour les contrôles non stimulés, remplissez les puits avec 20 microlitres de milieu salin D’Aedes Schneider. Une fois tous les puits remplis, versez de l’huile minérale hydratée dans le plat d’essai jusqu’à ce que les puits et les épingles Minutien soient submergés.
Après avoir immergé le tubule dans le puits, ramassez l’extrémité proximale du tubule avec une pince, retirez-la de la gouttelette de bain et enroulez l’extrémité autour de l’épingle. Enroulez le tubule autour de l’épingle deux fois en gardant la longueur du tubule restant dans la gouttelette de bain cohérente avec les autres tubules. Pour fabriquer une microélectrode sélective de sodium, utilisez une seringue d’un millilitre pour remplir l’électrode avec du chlorure de sodium de 100 millimolaires.
Assurez-vous que la solution de remblai se remplit jusqu’à l’extrémité de l’électrode. Si des bulles d’air apparaissent, faites glisser doucement la microélectrode ou retirez la solution et rechargez. Trempez une pointe de pipette de 10 microlitres dans la solution d’ionophore sélectif de sodium.
Alignez l’électrode perpendiculairement à la pipette, puis placez un doigt ganté sur le bas de la pointe pour créer une pression et expulser une petite goutte d’ionophore. Touchez délicatement la goutte d’ionophore à la pointe de la microélectrode, en veillant à ne pas la casser. Remplissez un petit bécher à mi-chemin avec du chlorure de sodium de 100 millimolaires et placez de la pâte à modeler à l’intérieur en haut du bécher.
Une fois l’ionophore absorbé, placez l’extrémité de l’électrode sur la paroi du bécher, en laissant les extrémités dans le chlorure de sodium. Conservez ISME dans le bécher jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Pour fabriquer l’électrode de référence ISME, remplissez une électrode avec du chlorure de potassium de 500 millimolaires et stockez-la dans un bécher.
Enduire les extrémités de l’électrode à l’aide d’une solution d’environ 3,5% de chlorure de polyvinyle, dissous dans du tétrahydrofurane, pour éviter le déplacement de l’ionophore lorsqu’il est immergé dans de l’huile de paraffine. Pour calibrer l’électrode de sodium, placez 10 gouttelettes de microlitres de concentrations étalons de chlorure de sodium sur le bord de la boîte ramsey avec les tubules malpighiens incubés. Placez les gouttelettes standard à deux centimètres l’une de l’autre avec la concentration la plus élevée sur le dessus.
Insérez à la fois l’électrode de référence et l’électrode sélective d’ions sur les fils de chlorure d’argent et fixez-les solidement à l’aide de porte-électrodes fixés à des micro-manipulateurs. Dirigez les deux électrodes vers la gouttelette de chlorure de sodium de 200 millimolaires à l’aide des micro-manipulateurs, en veillant à ce que les électro-pointes ne touchent pas le fond de la boîte. Allumez l’électromètre pour commencer l’enregistrement et permettre à la lecture de se stabiliser.
Enregistrez la lecture et passez à la norme suivante. Après avoir acquis des mesures de la vitesse de sécrétion de fluide, déplacez soigneusement les électrodes de référence et les électrodes sélectives d’ions dans la gouttelette sécrétée à l’aide des micro-manipulateurs. Activez l’enregistrement et laissez la lecture se stabiliser, puis enregistrez.
Allumez l’amplificateur ionique/polarographique IPA-2, le microscope optique et les ordinateurs. Placez la microélectrode sélective de sodium sur un support constitué d’un fil de chlorure d’argent et fixez-la dans la prise de connecteur femelle. Retirez une électrode de référence du bécher avec le chlorure de potassium, en plaçant un doigt à une extrémité et en inclinant le capillaire en verre vers ce doigt pour empêcher la gélose de tomber.
Placez soigneusement une extrémité dans le support, en vous assurant qu’aucune bulle ne se forme. S’il y a une bulle, retirez l’électrode de référence, remplissez le support avec trois molaires de chlorure de potassium et répétez. Placez le porte-électrode dans la prise de connexion femelle.
Après l’étalonnage, disséquez l’organe. Placez la boîte de poly-L-lysine avec l’échantillon disséqué sur l’étage du microscope et insérez la pointe de l’électrode de référence à l’intérieur de la solution saline. Immergez la pointe de la microélectrode sélective d’ions dans la solution saline, en prenant soin de ne pas casser la pointe.
Utilisez les boutons de réglage manuel pour régler la position de la microélectrode tout en regardant sous le microscope optique. Ajustez la position verticale de la microélectrode de sorte que sa pointe soit sur le même plan que l’organe ou le tissu, puis tournez l’interrupteur du moteur pour l’activer. À l’aide des touches fléchées de l’ordinateur, déplacez la microélectrode horizontalement dans une position située à trois millimètres du tissu pour mesurer les enregistrements d’arrière-plan.
Lorsque vous êtes prêt, commencez à enregistrer en appuyant sur F5, obtenez cinq mesures de l’activité de fond. Déplacez la pointe de la microélectrode près du tissu en prenant soin de ne pas percer l’organe. Réduisez la sensibilité à l’impact de la touche pour placer la pointe de la microélectrode de deux micromètres directement à droite, perpendiculairement au tissu.
Obtenez trois enregistrements sur le site le long du coussinet rectal pour identifier le site de la plus grande activité ionique, puis obtenez des mesures salines de base sur le site affichant la plus grande activité. Pour enregistrer les contractions de l’intestin postérieur, remplissez l’un des puits du plat avec un volume connu de solution saline Aedes. Après la dissection, transférez soigneusement l’intestin postérieur disséqué attaché à l’intestin moyen dans un puits dans un autre plat, en veillant à ne pas pincer l’iléon.
Immergez l’intestin dans la solution saline à l’intérieur du puits et placez les broches Minutien dans l’intestin moyen et le rectum. L’iléon ne doit pas être sous tension et des contractions spontanées provenant de la valve pylorique de l’iléon antérieur doivent être observées. Connectez la caméra vidéo au microscope stéréoscopique.
Placez ensuite le plat contenant l’organe disséqué sous le microscope et enregistrez une vidéo pendant deux minutes. L’application de DH31 contre des tubules malpighiens non stimulés entraîne une augmentation significative du taux de sécrétion de liquides, confirmant son rôle en tant qu’hormone diurétique chez les moustiques Aedes. Lorsque les tubules sont traités avec AedaeCAPA-1, une réduction du taux de sécrétion est observée dans les tubules de Malpighian stimulés par DH31.
Des électrodes sélectives d’ions ont été utilisées pour mesurer les concentrations de sodium dans les gouttelettes sécrétées. Le traitement du DH31 sur les MT n’a eu aucun effet sur la concentration de sodium dans la gouttelette sécrétée. Cependant, avec l’application d’AedaeCAPA-1, la concentration de sodium dans le liquide sécrété a été significativement augmentée.
De plus, par rapport aux témoins non stimulés, le DH31 a conduit à un taux de transport du sodium significativement plus élevé, tandis que AedaeCAPA-1 a aboli cette augmentation des tubules stimulés par le DH31. Le SIET a été utilisé pour évaluer les changements dans le transport du sodium le long de l’épithélial rectal des moustiques femelles adultes. Un analogue de la leucokinine a été utilisé pour examiner les changements dans l’absorption du sodium, ce qui a entraîné une diminution de quatre fois de l’absorption du sodium par rapport au contrôle salin.
Pour évaluer le rôle d’un neuropeptide pyrokinine2 sur la motilité iléale, un analogue de Rhodnius prolixus a été utilisé, dont il a été précédemment démontré qu’il active le récepteur A.aegypti PK2 enrichi dans l’iléon du moustique. Par rapport aux niveaux de base, PK2 inhibe de manière significative les contractions iléales. Lors de la réalisation d’un test de Ramsay avec des tubules de Malpighian et de la mesure des taux de sécrétion d’ions ou de liquide, il est impératif que les tubules ne soient pas endommagés pendant la dissection ou pendant le transfert dans la boîte d’essai.
Après le test de Ramsay, des transporteurs membranaires spécifiques peuvent être ciblés pharmacologiquement ou moléculairement en utilisant des techniques de génétique inverse pour discerner leur contribution spécifique au transport transépithélial des solutés dans l’épithélium simple.
