Ce modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires impliquant la pathogenèse de l’uvéite postérieure humaine à médiation immunitaire. L’implication de cette technique s’étend à l’étude translationnelle de l’uvéite humaine dans le suivi de l’efficacité des nouveaux médicaments et pour fournir un aperçu mécaniste de la progression de la maladie chimique. Le principal avantage de l’utilisation de ce modèle est la fiabilité de l’induction de la maladie et l’utilisation de techniques endoscopiques non invasives qui nous permettent de surveiller la progression de la maladie.
Ici, nous décrivons comment induire la maladie et évaluer la pathologie à l’aide de plusieurs lectures Pour préparer l’IRBP 1-20 complet Freund Adjuvant ou CFA, remettez en suspension une quantité calculée du peptide dans un volume minimum de 100% DMSO. Lorsque la poudre est complètement dissoute, ajouter de petits volumes de PBS dans le tube jusqu’à atteindre le volume final calculé de PBS en fonction du nombre de souris à injecter en agitant doucement pour mélanger la solution. Après avoir préparé l’adjuvant de Freund complet, pipeter doucement et fréquemment la solution pour former un visque et une émulsion uniformément répartie tout en ajoutant la solution de peptide PBS DMSO goutte à goutte à un rapport de un pour un à la suspension.
Pour aérer les solutions, utilisez une pipette de 1000 microlitres réglée à 700 microlitres pour pipeter la solution à plusieurs reprises jusqu’à l’obtention d’une émulsion épaisse et crémeuse. Avant d’injecter la suspension peptidique, placez chaque souris à injecter dans une cage séparée et utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 23 pour administrer par voie intrapéritonéale 1,5 microgramme de toxine Bordetella pertussis dans 100 microlitres de milieu RPMI 1640 supplémenté avec 1% de sérum de souris à chaque animal. Lorsque la solution de toxine de la coqueluche a été injectée, la souris doit être maintenue dans une position semblable à une peau et la peau pincée pour former une structure semblable à une tente à l’arrière du cou.
Enfilez l’aiguille dans l’espace entre le doigt et le pouce et injectez 200 microlitres de l’émulsion IRBP sur la peau de la tente, en maintenant la pression après l’injection et en tournant la tête de l’aiguille pour fermer la peau avant la rétraction. Pour marquer la maladie clinique, le jour 21 après l’injection, confirmer un manque de réponse au réflexe pétal chez la souris injectée de peptide anesthésié et retenir l’animal dans une peau. Appliquer localement 1% de tropicamide et 2% de phényléphrine sur la cornée de chaque œil immédiatement après l’injection.
Lorsque les pupilles sont complètement dilatées, placez la souris sur une platine de microscope spécialement conçue. Positionnez le microscope pour un accès complet à la rétine. Ajustez l’oculaire tout au long du processus d’imagerie si nécessaire pour voir le disque optique et la rétine et acquérir des images de toute la zone rétinienne, en ajustant et en couvrant tous les coins de la périphérie.
Pour mesurer les fuites des vaisseaux, administrez 100 microlitres de fluorescéine à 2% par voie sous-cutanée à l’arrière du cou et repositionnez la souris de manière à ce que la rétine soit centrée au milieu de l’image en direct. Réglez le fundoscope sur un filtre d’excitation de la lumière bleue à 465 à 490 nanomètres avant d’acquérir une image de chacun à 1,5 et sept minutes après l’injection fluorescente. Lorsque toutes les images ont été acquises, administrer par voie intrapéritonéale un injectable anti-sédation pour la récupération et placer la souris dans une cage sur un tapis préchauffé avec accès à un régime humide trempé avec surveillance jusqu’à ce que la souris reprenne conscience.
Pour la notation clinique de la maladie des images, basez l’évaluation clinique sur la gravité de l’inflammation du disque optique, de la coiffe des vaisseaux rétiniens, de l’infiltrat de tissu rétinien et des dommages structurels. Évaluez chacun de ces paramètres sur une échelle de un à cinq. Le total collectif est représentatif de la maladie clinique pour l’ensemble de l’œil avec un score maximum de 20 pouvant être obtenu par œil.
Après l’imagerie du fond d’œil pour le critère clinique final de l’étude, euthanasier la souris. Pour l’analyse histologique, écartez les paupières pour accéder à l’œil entier, puis placez des pinces incurvées derrière le globe pour saisir le tissu conjonctif orbitaire et le nerf optique et énucléer l’œil. Placez l’œil énucléé dans un à cinq millilitres de 4% de glutaraldéhyde pendant au moins 15 minutes avant de transférer l’organe dans un à cinq millilitres de formaldéhyde à 10% pendant au moins 24 heures.
Après coloration histologique des tissus, selon les protocoles standard, attribuer des scores sur une échelle de zéro à trois en fonction du niveau d’infiltration des cellules immunitaires et du degré de lésion rétinienne. Les changements fundoscopiques sont classés au cours de la progression de la maladie comme des changements inflammatoires qui comprennent l’inflammation du tissu rétinien et du disque vasculaire et optique et des dommages structurels rétiniens, en plus des changements histologiques basés sur l’infiltration des cellules immunitaires et les déficiences structurelles. Ces changements cliniques et histopathologiques peuvent être classés et notés pour évaluer la progression de la maladie et l’efficacité de l’intervention thérapeutique.
Les fuites vasculaires sont également une caractéristique pathologique du modèle et de l’uvéite humaine. Comme illustré dans cette analyse, la fluorescéine peut être utilisée pour visualiser les fuites vasculaires comme une autre lecture de ce modèle. Il est essentiel pour les chercheurs de s’assurer que l’émulsion est préparée correctement sans signes de séparation entre les solutions.
Ils doivent être soigneusement mélangés et le produit final doit être lisse dans la texture. Cette procédure peut être combinée avec d’autres méthodes d’administration de médicaments et avec pour la cytométrie pour le phénotypage infiltrant les populations de cellules immunitaires rétiniennes.
