Ce protocole peut évaluer comment la livraison ciblée de gènes affecte la localisation et la fonction des cellules B-1a et peut être une approche utile de preuve de concept pour examiner les potentiels thérapeutiques génétiques in vivo. Cette méthode fournit une livraison génétique stable et relativement efficace aux cellules primaires B-1a et permet l’identification du phénotype cellulaire du donneur et le transfert post-adoptif de la fonction. Cette méthode peut être utilisée pour examiner divers processus des donneurs et des cellules hôtes in vivo, y compris la survie cellulaire, la prolifération et la fonction, et peut être appliquée à d’autres systèmes de transfert adoptifs.
La récolte du liquide péritonéal peut être délicate. Assurez-vous de désengager complètement les cellules pour maximiser la récupération et éviter de percer les intestins qui peuvent contaminer votre population de cellules péritonéales. Pour la collection péritonéale de cellules B-1, utilisez des ciseaux chirurgicaux droits pour faire une coupure superficielle dans l’abdomen d’un mâle de 12 à 14 semaines, mâle, CD45.1+apolipoprotein E souris à élimination directe, et utilisez des ciseaux incurvés pour peler la peau pour exposer la paroi péritonéale.
À l’aide d’une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 25, rincer la cavité péritonéale avec 10 millilitres de 37 degrés Celsius RPMI-1640 moyen. Et saisir la base de la queue pour permettre à la souris d’être complètement secoué d’un côté à l’autre pendant 15 à 20 secondes. Après avoir secoué, utilisez la seringue pour aspirer le liquide du côté inférieur droit du péritoine juste au-dessus du niveau de la hanche, près des intestins, en prenant soin d’éviter de perturber les dépôts de graisse épidydimale et les organes sous-jacents.
Après avoir recueilli de six à sept millilitres de lavage, distribuez le liquide dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Utilisez des forceps pour saisir la paroi péritonéale au-dessus du diaphragme pour permettre l’élévation verticale de l’animal afin que tout fluide restant reste au fond de la cavité péritonéale. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une petite coupure dans la paroi péritonéale au-dessus du foie sans couper le foie lui-même.
Et utilisez un tuyau en verre et une ampoule pour recueillir tout liquide péritonéal restant. Lorsque tout le liquide a été recueilli, aliquot les cellules péritonéales de lavage de toutes les souris et ajouter jusqu’à une fois 10 à la concentration de cellules huitième par tube dans des tubes de 50 millilitres sur la glace. Et sédimenter les cellules par centrifugation.
Resuspendez chaque granulé dans un millilitre d’anticorps anti-CD16/CD32 dilué à un rapport d’un à 50 dans le tampon d’essai pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter un volume égal de mélange maître d’anticorps biotinylated à chaque tube pour une incubation de 20 minutes à quatre degrés Celsius suivie d’un lavage en cinq millilitres de tampon d’essai par tube. Resuspendez les granulés avec le volume approprié de microbilles d’anti-biotine et la durée d’incubation appropriée selon la concentration cellulaire et la recommandation du fabricant suivie d’un lavage tampon d’analyse de cinq millilitres par tube.
Resuspendez chaque granulé dans 500 microlitres de tampon d’essai et primez le nombre approprié de colonnes de sélection magnétique avec trois millilitres de tampon d’essai par colonne. Transférer les cellules sur des colonnes amorcées recueillant l’élitente contenant des cellules B-1 enrichies dans un tube conique de 15 millilitres sur la glace. Lavez ensuite chaque colonne de sélection magnétique avec un tampon d’analyse supplémentaire jusqu’à ce que le volume global recueilli soit de 10 millilitres et résépendez la fraction cellulaire post-purifiée à une fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration dans le milieu de culture cellulaire B.
Pour stimuler les cellules péritonéales B-1 mis de côté au moins une fois 10 à la septième cellule pour un contrôle non transduced et diviser les cellules restantes en deux volumes égaux pour la transduction. Diluer les cellules à 1,5 fois 10 à la cinquième cellule par 150 microlitres de concentration moyenne et ajouter 150 microlitres de cellules aux puits d’une plaque à fond rond de 96 puits pour l’état de transduction. Ajouter ensuite 100 nanomolaires d’agoniste TLR9 à chaque puits et placer les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 16 à 18 heures.
Pour la transduction rétrovirale des cellules B péritonéales décongeler les stocks de particules rétrovirales de phosphate de calcium sur la glace et ajouter immédiatement à la commande et aux supernatants rétroviraux de récepteur de chimiokine à chaque puits de la plaque appropriée et de la multiplicité de l’infection de 20 à un en présence de 8 microgrammes par millilitre de polybrene et de bêta-mercaptoethanol frais à 55 concentration finale micromolaire. Lorsque tous les virus ont été ajoutés, spinfect les cellules par centrifugation et placer les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. À la fin de l’incubation, récolter les cellules pour les replaquées dans un milieu de cellule B frais et une incubation pendant la nuit.
Après épuisement magnétique d’autres types de cellules péritonéales, les cellules singlet vivantes dans la fraction post-épuisement ont une plus grande proportion de cellules CD19+B par rapport aux macrophages F4/80+, et un manque de cellules CD5hi CD19-T, et elles contiennent une fréquence accrue de cellules B-1a moyennes CD19+CD5 par rapport à la fraction de pré-épuisement. Et l’augmentation de la fréquence des sous-ensembles de cellules GFP+B-2, B-1, B-1a et B-1b traduits avec succès est directement corrélée à l’augmentation de la multiplicité des infections par le virus. Et l’efficacité de la transduction peut être encore augmentée à l’aide de 96 plaques bien rondes par rapport à l’utilisation de plaques de 24 puits ou de 6 puits.
La transduction par rétrovirus CXCR4-GFP peut induire une surexpression réussie de la cellule B-1 CXCR4 et une augmentation de la migration in vitro vers CXCL12 sans impact significatif sur la viabilité des cellules B. En outre, les cellules cd45.1+donor transférées adoptivement ont soutenu leur surexpression de CXCR4 après leur rétablissement de la moelle et de la rate des souris destinataires de CD45.2 17 semaines après transfert de cellule. Il convient de noter qu’une association positive entre l’expression CXCR4 et la localisation des cellules donneuses à la moelle osseuse, mais pas la rate, a été déterminée.
Avec une association positive observée entre les nombres de cellules donneurs dans la moelle osseuse et la quantité plasmatique de lipoprotéine anti-MDA-basse densité IgM. De nombreuses techniques supplémentaires peuvent être utilisées pour répondre à des questions telles que, quel est l’impact de la livraison ciblée de gènes sur le développement de la maladie ou quel donneur tire des facteurs sécrétés ont un impact sur la physiologie de l’hôte.
