Notre protocole observe que l’utilisation d’extraits rénaux de vaches et de porcs est une excellente ressource économique pour l’étude de la physiologie rénale, en particulier l’examen de la corrélation entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et d’autres analytes. Il a toujours été difficile de corréler vegf, un facteur de croissance essentiel dans l’angiogenèse des organes, avec d’autres protéines. Cette technique nous permet d’examiner l’association entre vegf et analytes tels que les hormones.
Cela fera certainement progresser notre base de connaissances concernant cet important facteur de croissance. Cette méthode peut être utile pour corréler d’autres analytes dans les extraits corticals rénaux en plus de ceux mentionnés dans cette vidéo. La démonstration visuelle aidera les autres à obtenir des résultats reproductibles sans aucune erreur d’échantillonnage.
L’utilisation de tissus frais est essentielle au succès de cette technique. Il est important d’obtenir des reins entiers frais immédiatement après l’abattage auprès d’un animal. Toujours transférer le tissu au laboratoire sur la glace.
Utilisez des ciseaux stériles, des forceps, un couteau et des boîtes de Pétri pour disséquer les reins et exciser la partie tissulaire requise. Couper doucement le rein en deux le long du plan sagittal et couper un morceau de tissu de la région du cortex au centre du rein. Hacher le tissu en petits morceaux avec le couteau et le transférer dans un tube de microfuge avec un millilitre de glace froide 1X RIPA tampon d’extraction de lyse.
Étiquetez le tube avec des détails spécifiques de l’échantillon et placez-le sur la glace. Utilisez un homogénéiseur portatif avec une sonde stérile pour homogénéiser le tissu pendant une à deux minutes jusqu’à ce qu’aucun morceau ne soit visible, puis centrifugez immédiatement le tube à 9 600 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, préparer des aliquots distincts de l’échantillon pour l’ELISA et l’analyse totale des protéines afin d’éviter de multiples cycles de gel/dégel.
Avant de commencer l’analyse, amener tous les reagents et la plaque d’essai à température ambiante en enlevant les puits excédentaires et en les stockant à quatre degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. Diluer le tampon de lavage 20X à 300 millilitres avec de l’eau distillée double et installer les puits vierges sans aucune solution. Ajouter 50 microlitres de norme ou d’échantillon et 50 autres microlitres de peroxydase de raifort conjugués à chaque puits, puis ajouter immédiatement 50 microlitres de solution d’anticorps à chaque puits et sceller la plaque.
Mélanger l’assiette et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, laver chaque puits avec 200 microlitres de tampon de lavage. Ajouter 50 microlitres de substrat A et substrat B à chaque puits, mélanger délicatement la plaque en tapant sur le côté, puis sceller et l’incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.
Ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits. Appuyez doucement sur la plaque et lisez l’absorption à 450 nanomètres avec un spectrophotomètre. Préparer les réaccentrages et laver le tampon tel qu’il a été décrit précédemment, puis ajouter 100 microlitres de norme ou d’échantillon à chaque puits, sceller la plaque, bien mélanger et l’incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Retirer le liquide dans chaque puits et ajouter 100 microlitres de réaccent de détection A.Seal la plaque et l’incuber pendant une autre heure. Ensuite, lavez chaque puits avec 400 microlitres de tampon de lavage, puis ajoutez 90 microlitres de solution de substrat à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et incubez-la pendant une autre heure à 37 degrés Celsius. Après la dernière incubation, ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez l’absorption à 450 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre.
Estimer la protéine totale des extraits de rein bovin et porcin avec un test BSA standard et utiliser cette estimation pour normaliser les résultats de LH et VEGF-A-ELISA. Les niveaux moyen et médian de LH et de VEGF ont été calculés pour les animaux et les sexes. Après vérification de la normalité des données, des modèles linéaires de régression ont été utilisés pour examiner la relation entre LH et VEGF.
LH s’est trouvé pour être un prédicteur fort et significatif de VEGF dans les reins bovins et porcins. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler d’échantillonner des zones identiques dans chaque tissu. Une procédure similaire peut être utilisée pour extraire n’importe quel type de tissu.
N’oubliez pas de normaliser les analytes par extrait total de protéines de n’importe quel tissu que vous utilisez.
