Dans le but d’étudier l’intégrité intestinale de barrière, nous avons développé une méthode pour mesurer l’intégrité intestinale de barrière dans de petits organoïdes intestinaux de souris. En revanche, nous nous référons à la culture cellulaire monocouche utilisée, notre analyse est basée sur de petits organoïdes intestinaux tridimensionnels. L’adaptation d’un essai bidimensionnel à notre modèle était essentielle à sa praticité.
L’analyse est basée sur des organoïdes cultivés in vitro et son application aidera à définir les inducteurs et les inhibiteurs de l’intégrité de la barrière intestinale. La régulation des protéines de jonction serrées est une caractéristique importante de toutes les cellules épithéliales. Notre analyse permet la fonction et l’analyse de l’intégrité épithéliale de barrière.
Pour mesurer l’intégrité de la barrière des organoïdes isolés du tissu intestinal de la souris, préduire d’abord tous les tubes de centrifugation qui seront utilisés pour stocker les organoïdes pendant le processus de placage avec suffisamment de 0,1%BSA en PBS pour couvrir toutes les surfaces en plastique. Retirez immédiatement la solution BSA et placez les tubes sur la glace. Ensuite, décongelez la solution de matrice cellulaire et le milieu de culture organoïde sur la glace et retirez soigneusement le milieu de culture de chaque puits d’une plaque de culture organoïde de 48 puits.
Lavez chaque puits avec un millilitre de PBS froid avant de passer vigoureusement pour dissoudre les matrices cellulaires. Lorsque des suspensions cellulaires relativement homogènes ont été obtenues, lavez les organoïdes avec du PBS frais deux fois par centrifugation et réutilisez chaque culture organoïde dans 40 microlitres de milieu froid. Dissocier les grandes structures organoïdes à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres cinq fois pour recueillir des structures d’une taille de 40 à 60 micromètres et mélanger chaque suspension organoïde avec 40 microlitres de solution matricielle cellulaire fraîchement préparée.
Ajouter chaque suspension de solution de matrice de cellules organoïdes au centre des puits individuels d’un coverslip de huit puits chambés et placer la glissière sur un sac de glace pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, placez la glissade à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 minutes pour permettre la polymérisation de la structure de la matrice des cellules organoïdes avant d’ajouter 150 microlitres de culture organoïde moyenne à chaque puits pendant une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, traiter les puits de contrôle positifs avec 10 nanogrammes par millilitre d’interféron murinant recombinant gamma pendant 48 heures.
Pour effectuer un test de perméabilité, transférez le coverslip chambré à la chambre d’incubation réchauffée de 37 degrés Celsius d’un microscope confocal inversé et réglez le dioxyde de carbone de la chambre à 5 %Verrouillez le coverslip étroitement sur l’étape du microscope et ajustez les paramètres d’imagerie du microscope pour visualiser les organoïdes dans un puits de la chambre. Ensuite, ajoutez trois microlitres de lucifer jaune Lucifer fraîchement préparé 100 millimlaires dans 150 microlitres de moyen à un puits pendant une heure d’incubation dans la chambre de microscope. À la fin de l’incubation, ajuster l’accent pour visualiser le lumen de l’organoïde de référence et définir l’énergie laser requise pour l’excitation jaune Lucifer et la sensibilité de détection respective de l’instrument pour imager le signal jaune Lucifer à 30 à 40% de la plage dynamique disponible de l’instrument.
Alternativement, l’intensité du signal peut être modifiée en changeant le temps d’exposition. Pour trouver les positions d’environ 10 organoïdes avec une structure sphérique près de la surface de coverslip par puits par interférence différentielle contrastent l’imagerie vivante, capturant des organoïdes avec des diamètres comparables et se concentrant sur la tranche centrale des organoïdes pour imager les lumens. Enregistrez le contraste différentiel d’interférence et la fluorescence jaune Lucifer de chaque position pour documenter la forme et l’auto fluorescence de chaque organoïde.
Lorsque tous les organoïdes ont été photographiés, ajouter 150 microlitres de milieu, y compris le jaune Lucifer, aux puits de traitement jaune Lucifer et l’image de tous les puits toutes les cinq minutes pendant 70 minutes. À la fin de la séance d’imagerie, ajouter quatre microlitres d’EGTA fraîchement préparés à 100 microlitres de milieu. Ajouter l’EGTA dilué aux puits appropriés.
Ensuite, enregistrez la fluorescence des organoïdes dans chaque puits toutes les cinq minutes pendant 30 minutes. Assurez-vous de pratiquer la manipulation et la culture ou organoïdes à l’avance que la viabilité cellulaire et l’intégrité sont une condition préalable pour le succès de l’essai. Dans cette expérience représentative, après 70 minutes de traitement avec lucifer jaune intraluminal Lucifer fluorescence jaune n’était visible que chez les organoïdes des animaux sauvages traités avec l’interféron gamma.
Ni les contrôles non simulés, ni les organoïdes dérivés des animaux de knock-out de récepteur gamma d’interféron-2 n’ont montré la fluorescence jaune intraluminale de Lucifer à la fin de la période de traitement. L’ajout de l’EGTA a causé une dégradation non spécifique de l’intégrité de la barrière intestinale en séquestrant les co-facteurs serrés de jonction, ayant pour résultat la prise et l’expression jaunes de Lucifer dans tous les organoïdes indépendamment de l’origine ou des conditions de traitement. Les valeurs d’intensité relative pour le niveau de fluorescence jaune de Lucifer dans le lumen organoïde et à l’extérieur de chaque organoïde peuvent également être quantifiées.
Assurez-vous de sélectionner des organoïdes avec une taille comparable autour de la configuration et de sélectionner l’axe défini afin que vous puissiez imaginer le lumen central de l’organoïde. En plus d’utiliser des substances induisant la dégradation de la barrière intestinale, nous pouvons également étudier des stratégies pour l’inhibition de la destruction des barrières intestinales. Comme cette méthodologie est basée sur les cellules primaires d’un seul animal, elle peut être utilisée pour de nombreux tests, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience.
