Notre protocole fournit une méthode de vérification améliorée pour le chimérisme de circulation et une méthode pour la configuration réussie de modèle de parabiosis pour la recherche biomédicale. Comparé aux méthodes existantes pour la détection du chimérisme sanguin dans la parabiose qui sont souvent mortelles ou lourdes, notre protocole est sûr et simple, permettant une vérification rapide et fiable. Bien que cette méthode soit spécifique à la détection du chimérisme sanguin dans les modèles de parabiose, elle peut être appliquée à toutes les études biomédicales impliquant des procédures parabiotic.
L’étape la plus difficile est l’injection de glucose. Par conséquent, assurez-vous de pratiquer l’injection de veine de queue avant d’effectuer une procédure expérimentale, ou d’utiliser un fixateur de queue de souris visuelle veineuse. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, placez deux souris mâles noires C57 noires de 20 à 25 grammes en position supine, et utilisez un rasoir électrique pour bien raser le côté gauche d’une souris et le côté droit de la deuxième souris d’environ un centimètre au-dessus du coude à un centimètre sous le genou.
Retirer les cheveux restants avec de la crème depilatory avant de faire des incisions cutanées longitudinales dans la peau défrichée de chaque animal, à partir de 0,5 centimètres au-dessus du coude à 0,5 centimètres sous l’articulation du genou, et détacher doucement la peau du fascia sous-cutané. Connectez l’olécranon et le genou du parabiont avec la suture 3-0, et suturez la peau rasée avec une suture continue de 5-0. Injectez ensuite sous-cutanément 0,5 millilitres de chlorure de sodium à 0,9 % pour prévenir la déshydratation, et injectez par voie intramusculaire 10 milligrammes de tramadol par 25 grammes de souris pour soulager la douleur, dans chaque souris par jour pendant trois jours.
Pour vérifier la construction réussie de la circulation entre le chimérisme entre les parabionts par fluctuation de glucose, le 10ème jour après chirurgie de parabiosis, fixez les souris donneuses dans un fixateur visuel veineux de queue de souris, et emploiez une boule de coton éthanol-trempée de 70 à 75% pour frotter les veines caudales dans le flanc d’une queue de parabiont. Insérez une aiguille de seringue d’un millilitre dans la veine caudale à deux ou quatre centimètres de la pointe de la queue et aussi parallèle à la veine que possible, et injectez un à deux grammes par kilogramme de glucose dans 100 microlitres de solution saline dans le donneur sur une période de 10 secondes. Utilisez ensuite des ciseaux pour enlever les ateils du donneur et des animaux receveurs afin de permettre la collecte d’une goutte de sang à divers moments d’intérêt après l’injection.
Ajoutez ensuite une goutte de chaque échantillon de sang au centre d’une bande d’essai de glucomètre pour la détection du niveau de glucose. Pour vérifier la construction réussie de la circulation par l’absorption de colorant bleu Evans, injecter 200 microlitres de 0,5%Evans contre-tache bleue intraperitoneally dans la souris donneur, et recueillir le sang des deux parabionts par perforation cardiaque après deux heures. Séparez le sérum par centrifugation, et transférez le sérum dans un tube conique pour la dilution à un rapport de un à 50 dans le chlorure de sodium de 0,9%.
Mesurez ensuite l’absorption des échantillons de sérum dilués à 620 nanomètres sur un spectrophotomètre. Dans cette analyse représentative des niveaux de glucose sanguin chez six souris donneuses, la glycémie a fortement augmenté à 26,5 micromolaires par litre à une moyenne d’une minute après l’injection de 100 microlitres de glucose par la veine de la queue. Les niveaux de glucose sanguin ont alors graduellement diminué à 13.3 microlitres par litre à 60 minutes.
Chez les souris receveurs, la glycémie a lentement augmenté après l’injection, atteignant le premier niveau de pointe à 15 minutes. La concentration de colorant bleu Evans dans le sérum des parabionts a également indiqué une construction réussie du chimérisme de circulation, et des jonctions vasculaires sous-cutanées entre les parabionts pourraient être clairement observées. Dans les parabionts qui n’ont pas établi le chimérisme de sang 15 jours après chirurgie de parabiosis, les souris destinataires n’ont pas exhibé un niveau accru de glucose sanguin dans les 60 minutes après injection de glucose dans l’animal de donneur.
La concentration sanguine de bleu Evans chez les deux receveurs n’a pas non plus été élevée, ce qui démontre que la méthode de fluctuation du glucose est aussi sensible que la méthode bleue Evans. En outre, le taux d’insuline dans le sang a été nettement diminué une heure après l’injection de glucose en raison de l’augmentation rapide des niveaux de glucose et récupéré à des niveaux normaux de trois heures, ce qui indique que les effets du glucose injecté sur le métabolisme de l’insuline sont réparables. Prenez soin de vous assurer que l’aiguille est insérée directement dans la veine de la queue.
Après avoir confirmé le chimérisme sanguin des parabionts par cette méthode, des changements physiopathologiques peuvent être étudiés chez les animaux parabiotic vivants.
