Identifier les mutations par fusion à haute résolution dans une population de riz de TILLING

Il serait très utile pour les caractères reproducteurs qui sont techniquement difficiles ou coûteux à déterminer, tels que la résistance aux maladies, la teneur en minéraux. C’est une technique assez simple, rentable et à haut débit. Pour commencer, placez quatre disques de feuilles dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits.

Ajouter 50 millilitres de solution tampon A dans chaque puits. Congeler la plaque dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, décongelez la plaque à température ambiante.

Incuber à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 50 microlitres de tampon B à chaque puits, et bien mélanger par vortex. Centrifuger la plaque pendant une minute à 1500 fois g.

Recueillir le supernatant comme ADN pour PCR. Tout d’abord, utilisez le supernatant d’ADN à partir d’un modèle ainsi que pcr pour optimiser la température d’annealing. Ajoutez des réaccents et un microlitre de supernatant d’ADN dans chaque puits PCR.

Placez les tubes PCR dans un bloc thermique capable de gradient et ajustez le programme de chauffage selon le manuscrit pour déterminer la température d’annealage optimale pour chaque fragment cible. Effectuer l’électrophoresis pour le produit PCR sur 1% gels agarose pour examiner les amplicons. Déterminez la température d’annealage optimale qui permet l’amplification spécifique du fragment cible.

Pour effectuer l’analyse de la MRH, combinez des reagents, y compris un microlitre de 10 fois le colorant fluorescence et un microlitre du supernatant d’ADN dans chaque puits de plaques compatibles avec la MRH. Dans chaque assiette, inclure un échantillon parent de type sauvage et un contrôle négatif sans ADN. Ajouter une goutte d’huile minérale à chaque puits pour éviter l’évaporation.

Ensuite, sceller la plaque avec un film adhésif, et centrifugeuse à 1000 fois g pendant une minute. Exécutez le PCR à l’aide de la température d’annealage optimisée. Maintenant, retirez le film adhésif de la plaque, et insérez la plaque dans une machine de MRH.

Dans le logiciel, sélectionnez New Run à partir du menu du fichier, ou appuyez sur le bouton Exécuter en haut de l’écran. Spécifiez les températures de départ et de fin de la fonte de 55 à 95 degrés Celsius. Sélectionnez des échantillons pour l’analyse de fusion à haute résolution et excluez les échantillons similaires au contrôle négatif.

Normaliser les courbes de fusion pour avoir le même début et la même fin de fluorescence. Confirmez visuellement que les curseurs à température maximale minimale et inférieure inférieure se trouvent dans une région des courbes. Gardez le delta F, différence de fluorescence, niveau au réglage par défaut de 05.

À partir de la liste de sélection des normes, sélectionnez la variante commune par rapport à la variante et choisissez la sensibilité normale. Sélectionnez H12 pour utiliser le type sauvage comme commande. Les échantillons d’une valeur delta F supérieure à 05 sont considérés comme contenant des plantes mutantes.

Ensuite, à l’aide d’une méthode CTAB, extraire l’ADN de chacune des quatre plantes de la piscine mutante avec la courbe de fusion significativement différente du type sauvage. Après quantification à l’aide d’un spectrophotomètre, ajuster l’ADN avec le NanoDrop 2000 à une concentration finale d’environ 25 nanogrammes par microlitre. Ajoutez 0,4 microlitres d’amorces PCR dans l’échantillon d’ADN dans les tubes PCR, placez-les dans un cycleur thermique et ajustez le programme pour amplifier le fragment cible.

Ensuite, envoyez les produits PCR à une entreprise pour séquençage. Après séquençage sanger, comparer la lésion moléculaire en comparant les séquences entre la plante M2 et le type sauvage. Dans cette étude, la numérisation et l’analyse des semis M2 pour les mutations dans les gènes OsLCT1 ou SPDT ont montré que la plupart des échantillons présentaient des courbes de fusion pas significativement différentes du type sauvage avec delta F inférieur à 05.

Les mutants ont montré des courbes de RMH significativement différentes avec des delta F supérieurs à 05 à des températures de 90 à 92 degrés Celsius et 81,5 à 83,5 degrés Celsius, respectivement. Le type de mutation et la position sur les gènes de 4560 semis M2 ont été confirmés par les chromatogrammes de séquençage. Un emplacement hétérozygote avec une mutation de G à A à 4,304 paires de base d’OsLCT1 a été identifié.

Un nucléotide unique Une insertion est apparue aux 4 240 paires de base d’OsLCT1, et une suppression trinucléotide TTC a été observée à la position de 5 948 à 5 950 paires de base de SPDT. J’optimise le PCR avant l’analyse HRM. Le colorant dans le gel est un peu nocif.

N’oubliez pas de mettre des gants lors de l’exécution du gel.