Ce protocole est significatif parce qu’il nous permet de visualiser le microenvironnement où les cellules produisent une cytokine donnée, ici, l’interféron gamma. Il est admis que la gamme d’action des cytokines est limitée parce que les tissus sont si complexes. Il est important de caractériser les cellules qui entourent les cellules productrices d’interféron gamma pour déterminer quelles cellules vont la prendre.
Le principal avantage de la technique est qu’elle ne perturbe pas le microenvironnement présent dans le tissu d’intérêt. En outre, parce que nous ne réimulas pas artificiellement les cellules pour les forcer à produire de l’interféron gamma, cela nous donne une meilleure caractérisation de la question de savoir si les cellules produisent activement des interféron gamma in situ. Ce protocole pourrait être potentiellement adapté à d’autres organes et à la visualisation d’autres cytokines.
La plupart des étapes de ce protocole sont simples, mais la manipulation du tissu, la congélation et la section, doit être effectuée avec soin pour préserver l’intégrité du tissu. Pour commencer, transférez 300 microlitres de LM cultivés génétiquement modifiés à l’OVA exprimée à une infusion de coeur de bouillon à 37 degrés Celsius dans un flacon. Placez le flacon sur un shaker pour que l’agitation douce pousse le LM à une phase exponentielle jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 0,08 à 0,1.
Après avoir dilué la culture LM OVA dans PBS à une concentration de 0,1 fois la dose létale, 50% utilisent une seringue d’insuline de calibre 29 pour injecter par voie intraveineuse 100 microlitres dans des souris noires C57 de type 6 sauvages portant des cellules OT1 GFP ou OT1 RFP. Pour bloquer la sécrétion de cytokine 6 heures avant le sacrifice de la souris, injectez 250 microgrammes de BFA et 200 microlitres de PBS intraperitoneally avec la seringue d’insuline de calibre 29. Après l’euthanasie des souris utilisant le dioxyde de carbone et la dislocation cervicale suivante, nettoyez l’abdomen avec 70% d’éthanol.
Sur le flanc gauche de la souris où se trouve la rate, couper à travers la peau avec des ciseaux pour faire une incision d’un à deux centimètres. Ensuite, faites soigneusement une incision dans le péritoine pour exposer la rate et la sortir avec des pinces à épiler. Veillez à ne pas le presser avec des forceps ou le couper pour éviter de perturber l’architecture de la rate.
Maintenant, préparez la solution fixative en mélangeant 3,75 millilitres de PBS et 3,75 millilitres de 0,2 molaire L-lysine. Ajouter 21 milligrammes de m-periodate de sodium et bien mélanger. Ajouter ensuite 2,5 millilitres de 4 % de PFA et 20 microlitres de 12 hydroxyde de sodium normal.
Couper la rate en trois parties. Submerger la rate dans le fixatif dans une plaque de six puits et fixer pendant au moins quatre heures. Une période de fixation typique est de 16 à 20 heures à quatre degrés Celsius sous une agitation douce.
Après cela, jeter la solution fixative et ajouter cinq millilitres de PBS pendant cinq minutes à température ambiante sous une agitation douce. Ensuite, remplacez le PBS par cinq millilitres de saccharose à 30 % et incubez pendant 12 à 24 heures pour maintenir la morphologie tissulaire. Maintenant, l’organe coule au fond de la plaque.
Pour congeler l’échantillon, mettre la glace sèche dans un grand réceptacle et placer un récipient plus petit à l’intérieur contenant environ 50 millilitres de méthanol pur et quelques morceaux de glace sèche. Sécher délicatement la rate sur un lingette sans peluche. Égouttez une goutte de composé OCT au fond du moule de base et placez la rate à l’intérieur du moule.
Veillez à ne pas produire de bulles. Ajouter environ un millilitre d’OCT sur la rate. Avec des forceps, déposer le moule de base sur la surface du méthanol dans le bain de glace sèche, en s’assurant que le méthanol ne touche pas l’OCT.
L’OCT s’épaissit et devient blanc lorsqu’il est congelé. N’oubliez pas de congeler le tissu aussi rapidement que possible pour minimiser les artefacts. Sur un cryo-microtome, réglé à la température de moins 20 degrés Celsius.
Section du tissu à l’épaisseur désirée, environ 10 micromètres. Utilisez une brosse pour recueillir des sections sur des glissières de microscope en verre et inspecter visuellement. Laissez les sections arriver à température ambiante.
Dessinez un cercle avec un bloqueur liquide, par exemple, un stylo PAP, autour de la section tissulaire à l’extérieur de l’OCT. Une fois que le tissu a séché, réhydrater l’échantillon en dégoulinant 100 microlitres de PBS sur la section tissulaire pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le PBS de la section par aspiration et ajoutez 100 microlitres de solution de blocage par section d’échantillon.
Incuber dans une chambre humide couverte pendant au moins une heure à température ambiante. Pour tacher avec des anticorps primaires, remplacez la solution de blocage par le mélange d’anticorps primaires préparé pour chaque échantillon. Incuber pendant quatre heures à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humide couverte avant de se laver selon le manuscrit.
Maintenant, diluer les anticorps secondaires d’intérêt à une concentration optimale, généralement 2,5 microgrammes par millilitre, dans la solution de blocage. Retirez la solution de lavage finale de la section et ajoutez le mélange d’anticorps secondaire préparé sur le dessus de la section et incubez pendant une à quatre heures à température ambiante dans une chambre humide couverte. Après le lavage avec tampon de lavage selon le manuscrit, retirez la solution de lavage et effectuez un lavage final avec PBS.
Aspirer la solution saline tamponnée de phosphate et permettre au PBS restant de s’évaporer sans que la section ne se dessèche complètement. Dessinez un cercle autour de la section à l’arrière de la diapositive. Ensuite, placez une goutte du milieu de montage sur le dessus de l’échantillon, en vous assurant que le milieu couvre toute la section et placez soigneusement un verre de couverture sur le dessus.
Laissez l’échantillon polymése pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Le matin, placez la glissière sous un microscope à balayage laser spectral inversé. Ajustez l’objectif à 10x NA 0.40 ou 60x NA 1.4 pour l’analyse de la localisation subcellulaire de cytokine.
Dans ce protocole, les cellules qui produisent l’interféron gamma sont visualisées et localisées. Le marqueur F4/80 marque tous les macrophages et met en évidence la pulpe rouge. Le marqueur B220 étiquette les cellules B et met en évidence les follicules cellulaires B entourant la zone des cellules T.
Le marqueur CD169 étiquette les macrophages marginaux de zone entourant la pulpe blanche. 24 heures après l’infection, l’interféron gamma est produit par plusieurs cellules, y compris les lymphocytes T OT1 CD8 spécifiques aux antigènes activés et les cellules NK. Sans l’utilisation de BFA pour inhiber la sécrétion de cytokine, la détection du gamma d’interféron par des cellules de NK a été considérablement altérée.
Les cellules B, les macrophages marginaux de zone, et tous les macrophages ont été tachés pour délimifier l’emplacement des cellules productrices gamma d’interféron suivant l’infection de LM OVA. Fait intéressant, des cellules T spécifiques à l’antigène groupé ont été trouvées dans toute la pulpe blanche de la rate, mais elles ne produisent du gamma d’interféron que dans les régions où les cellules NK coexistaient avec elles. Différentes localisations subcellulaires de l’interféron gamma et du NK par rapport aux lymphocytes T positifs CD8 ont été montrées.
Tandis que la localisation gamma d’interféron dans les cellules de NK a été diffusée dans le cytosol, CD8 t-cells positifs ont souvent recruté le gamma d’interféron vers une autre cellule T. L’injection de brefeldine A est cruciale pour détecter la cytokine in situ. Les cellules sécrètent et prennent souvent rapidement les cytokines et nous devons inhiber la sécrétion de cytokine pour la laisser s’accumuler dans les cellules.
Cette méthode est un outil de découverte qui place en arrière les cellules productrices de cytokine dans leur environnement natal. Le décryptage de la composition de cet environnement nous permet de nous concentrer sur les bonnes cellules ou médiateurs immunitaires présents à cet endroit qui peuvent avoir un impact ou être impactés par l’interféron gamma. On comprend de plus en plus que la localisation précise d’une cellule dans un tissu est cruciale pour sa fonction.
Notre protocole nous permet d’identifier la localisation des cellules productrices de cytokine et ainsi de caractériser davantage sa fonction.
