Ce protocole montre qu’il est possible de générer de nouveaux neurones directement dans le cerveau à partir de glia résidents et que ces cellules reprogrammées mûrissent en neurones spécifiques au sous-type. Le principal avantage est le virus AAV dépendant de la cre qui permet un ciblage spécifique de la NG2-glia et le journaliste GFP qui étiquette les neurones reprogrammés pour analyse. Générer de nouveaux neurones dans le cerveau peut conduire à un développement futur pour les thérapies de remplacement cellulaire dans le cerveau.
Dans notre protocole, nous générons les interneurones parvalbumin-positifs qui ont des implications pour les troubles psychiatriques. La reprogrammation in vivo peut être appliquée à d’autres zones et circuits cérébraux en fonction de l’état neuronal de phénotype et neurologique que vous souhaitez cibler. Jenny Johansson: technicienne, Maria Pereira, ancienne doctorante, et Marcella Birtele, doctorante dans notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour produire un vecteur viral AAV5, grainez les cellules HEK293T avec un milieu de culture standard dans cinq flacons T175. Lorsque les cellules atteignent 50 à 70% de confluence, préparer le mélange suivant pour la transvection. Dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, ajouter des quantités molaires égales de plasmide vectoriel, et plasmide d’aide de série pDG.
Ajouter le tampon Tris-EDTA à un volume final de 144 microlitres puis ajouter de l’eau ultrapure pour obtenir un volume total de 1296 microlitres et mélanger. Ensuite, ajouter 144 microlitres de chlorure de calcium molaire de 2,5 molaires et mélanger. Après cela, ajouter 1,92 millilitres de HBS à la solution d’ADN et vortex immédiatement.
Incuber à température ambiante pendant exactement 60 secondes. Par la suite, transférer la solution à 28 millilitres de milieu de culture cellulaire fraîche et mélanger. Remplacer le milieu dans les flacons par le mélange de transvection moyen.
Attendez trois jours et transférez les médias au gaspillage. Ajouter cinq millilitres de tampon de récolte à chaque flacon, puis ajouter quatre millilitres de DPBS à chaque flacon pour rincer les cellules restantes et mettre en commun avec la solution cellulaire. Centrifugeuse les cellules récoltées à 1000 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après centrifugation, retirer le supernatant et dissoudre la pastille en 15 millilitres de tampon de lyse. Congeler le tube de centrifugeuse de 50 millilitres sur la glace sèche pendant 15 minutes et les conserver dans un congélateur de moins 20 degrés Celsius. Avant utilisation, décongeler la cellule récoltée lysate dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.
Dans cette procédure, effectuer la purification de l’AAV par ultracentrifugation de gradient iodoxanol et utiliser des tubes de plafond ultracentrifugeuse avec centrifugation à 350 000 x g pendant une heure et 45 minutes à température ambiante. Pour extraire la phase contenant l’AAV, insérez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18 à environ deux millimètres au-dessous de la bordure de phase de 40 à 60 %, le biseau faisant face vers le haut et se retirant. Assurez-vous de vous arrêter avant d’atteindre la bande protéique après l’extraction de cinq à six millilitres du vecteur viral.
Ensuite, purifiez et concentrez le gradient iodixanol dilué à travers un filtre d’échange d’anions, en le poussant à travers à un taux pas plus rapide qu’une goutte par seconde. Par la suite, poussez trois millilitres de tampon IE lentement à travers le filtre pour le laver. Ensuite, élitez le mélange dans une unité de filtre centrifuge avec un à deux millilitres de tampon d’élitution.
Ajoutez DPBS à l’appareil à un volume final de quatre millilitres. Centrifugeuse à 2000 x g à température ambiante jusqu’à ce que moins de 0,5 millilitres de DPBS reste dans le filtre. Par la suite, retirer le liquide du fond du tube, le remplir de quatre millilitres de DPBS et la centrifugeuse à nouveau.
Répétez cette étape deux fois de plus, assurez-vous que le volume de vecteur concentré sur le filtre est d’environ 200 microlitres après la dernière centrifugation. Retirez le vecteur concentré de 200 microlitres à l’aide d’une pipette et poussez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre pour le stériliser. Ensuite, aliquot 200 microlitres dans un flacon de verre avec insert imbriqué.
Pour injecter des facteurs de reprogrammation, placez une souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique. Administrer l’analgésie appropriée au début de la chirurgie, puis apporter la pointe du capillaire en verre de l’aiguille d’injection juste au-dessus bregma. Assurez-vous que la pointe capillaire est parfaitement droite dans les avions A-P et M-L.
Réinitialisez les valeurs M-L et A-P à 0,0 sur le compteur de coordonnées numériques. Pour vous assurer que la tête de l’animal est en position parfaitement plate, utilisez le compteur de coordonnées numériques pour mesurer la valeur de coordonnées D-V lorsque le bras A-P est à plus 2,0 et moins 2,0 ainsi que lorsque le bras M-L est à plus 2,0 et moins 2,0. Ajustez la hauteur de la barre dentaire et des barres d’oreille en conséquence.
Par la suite, soulevez légèrement la seringue et percez un trou à l’aide d’une perceuse dentaire aux coordonnées d’injection. Commencez à forer sur le site, en travaillant d’une manière circulaire et douce. Ensuite, placez un morceau de gaze de coton sur l’incision ouverte et rincez la seringue avec une solution saline.
Après le rinçage, dessinez une bulle d’air, puis un microlitre de solution contenant le vecteur viral. Assurez-vous que la solution virale peut être facilement visualisée sous la bulle d’air. Ensuite, abaissez la seringue, progressant lentement à la profondeur désirée, et assurez-vous que la trajectoire est claire des fragments d’os.
Par la suite, injecter un microlitre de la solution virale à un taux de 0,4 microlitres par minute. Lorsque l’injection est terminée, prévoyez deux minutes de diffusion avant le retrait de la seringue. Après diffusion, rétractez lentement la seringue jusqu’à ce que la pointe du capillaire soit complètement retirée du cerveau, puis suturez soigneusement l’incision et retirez l’animal du cadre stéréotaxique.
Surveillez l’animal dans une station postopératoire jusqu’à ce que la conscience soit retrouvée. Les animaux sont gardés jusqu’à 12 semaines après l’injection du virus pour permettre aux gliales résidentes de se reprogrammer dans des neurones matures. Pour préparer des tranches de cerveau pour l’électrophysiologie à l’aide d’un vibratome, section du cerveau de la partie la plus rostrale jusqu’au niveau striatal à grande vitesse.
Ensuite, section du striatum coronally à 275 micromètres à 0,1 millimètre par seconde. Après chaque section, retirez soigneusement le côté striatal non injecté et transférez le côté injecté dans un flacon avec un filet inférieur et une glissière de sens CREB oxygénée dans le bain d’eau à température ambiante. Gardez le flacon à température ambiante jusqu’à ce que toutes les sections soient coupées.
Ensuite, augmentez lentement la température du bain d’eau à 37 degrés Celsius et laissez-la pendant 30 minutes, puis éteignez le chauffe-eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Après avoir transféré une section de tissu dans une chambre d’enregistrement pour l’électrophysiologie, montez la pipette en verre sur l’électrode d’enregistrement et abaissez-la dans la solution. Vérifiez la résistance de l’électrode.
Ensuite, approchez lentement de la cellule reprogrammée avec la pipette, en gardant une légère pression positive dans l’électrode pour éviter de brancher la pointe, et vérifiez que la cellule est GFP positive avant le patchage. Lorsque la cellule est patchée, maintenir la cellule dans la pince actuelle de moins 60 à moins 70 millivolts, et injecter des courants de 500 millisecondes de moins 20 à plus 90 picoamperes avec 10 incréments picoampere pour induire des potentiels d’action. Ceci est indicatif d’une maturation neuronale et d’une reprogrammation réussie.
Par la suite, passez à la pince de tension et mesurez le sodium vers l’intérieur et retardez la rectification des courants de potassium à des étapes dépolarisantes de 10 millivolts. Voici un neurone reprogrammé rempli de biocytine post-enregistrée qui montre la morphologie neuronale mature et les épines dendritiques. Ici, les enregistrements électrophysiologiques des neurones reprogrammés montrent la présence de connexions fonctionnelles postsynaptiques avec des mesures spontanées d’activité.
Les traces montrent l’activité inhibitrice qui est bloquée avec la picrotoxine, un antagoniste des récepteurs GABAA et l’activité excitatrice qui est bloquée par CNQX, un antagoniste des récepteurs AMPA. Les neurones patchés montrent déjà l’activité postsynaptique à cinq semaines après injection, et continuent à huit et 12 semaines après injection. Le nombre de neurones ayant des potentiels d’action induits par le courant augmente également avec le temps.
Une analyse plus détaillée a indiqué plusieurs modèles distincts de tir où la majorité des cellules montrent l’activité de spiking rapide semblable aux interneurones de parvalbumin. L’analyse immunohistochimique à 12 semaines plus loin a montré la co-expression du journaliste GFP et de la parvalbumin. Suite à cette procédure, vous pouvez examiner l’expression du gène avec patch chercher la technique ou d’évaluer la connectivité synaptique tridimensionnelle avec le traçage monosynaptique et iDISCO.
Maintenant qu’il est possible de reprogrammer les glia résidents en parvalbumine exprimant des interneurones, nous avons commencé à étudier si elles sont authentiques et peuvent être utilisées comme un outil thérapeutique. N’oubliez pas de suivre les protocoles et les lignes directrices établis lors de la manipulation des animaux et de l’utilisation du virus AAV.
