Dans le cerveau, une paire de neurones forment souvent de multiples contacts synaptiques, ce qu’on appelle la multiplicité synaptique. Cependant, l’examen précis de la multiplicité synaptique nécessite des expériences techniquement difficiles. Ce protocole décrit une méthode simple pour l’estimation brute de la multiplicité synaptique utilisant l’électrophysiologie de patch-clamp de cellule entière.
Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle espèce et région du cerveau pour étudier la multiplicité synaptique. Cette méthode exige des compétences de base en électrophysiologie patch-clamp à cellules entières. L’obtention d’enregistrements de haute qualité avec une résistance d’accès faible et stable est essentielle pour l’interprétation précise des données.
Pour obtenir la configuration de cellule entière, placez la pipette d’enregistrement juste au-dessus de la tranche et compensez le courant de pipette dans le mode de pince de tension. Appliquez une légère pression positive sur la pipette et verrouillez le robinet d’arrêt. Ensuite, choisissez une cellule saine avec une membrane intacte, et approchez le tissu avec la pipette.
La pression positive devrait causer une légère perturbation sur le tissu. Rapprochez lentement la pipette de la cellule en diagonale jusqu’à ce qu’une petite fossette soit formée à la surface de la cellule. Ensuite, relâchez le verrou de pression positive.
La cellule commencera à former un joint, et la résistance augmentera au-dessus d’un gigaohm. Dans la pince de tension, maintenez la cellule à moins 68 millivolts. Par la suite, retirez légèrement la pipette de la cellule en diagonale pour enlever l’excès de pression.
Compensez la capacité rapide et lente de pipette. Appliquez une brève aspiration à travers le tube relié au support pipette pour percer la cellule et obtenir une configuration de cellule entière. Ensuite, passez en mode cellulaire sur la fenêtre de test membranaire dans un logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie.
Maintenir la température du bain d’enregistrement à 27 à 30 degrés Celsius et le débit à 1,5 à 2 millilitres par minute pour les expériences subséquentes. Dans une synapse de multiplicité, un potentiel d’action synchronise la libération de neurotransmetteur et génère un courant postsynaptique plus grand. Le blocage du potentiel d’action et de la libération vésiculaire dépendante du calcium avec TTX et cadmium empêche la summation du courant postsynaptique et diminue l’amplitude.
Lorsqu’il n’y a pas de multiplicité, le potentiel d’action de blocage ne changera pas l’amplitude. Dans l’expérience 1, pour estimer la multiplicité, maintenez la cellule à moins 68 millivolts tout en la perfusant avec l’aCSF à faible teneur en calcium. Enregistrez les CPE spontanés pendant au moins cinq minutes pour assurer une base de référence stable.
Ensuite, ajoutez 30 micromolaires 4-AP à l’ACSF pour augmenter les événements d’action dépendant du potentiel, et enregistrez les CPE spontanés pendant au moins 10 minutes pour obtenir l’effet médicamentif complet. Ensuite, ajoutez 0,5 micromolaires TTX et 10 micromolaires cadmium à l’aCSF avec 4-AP, et enregistrez les CPE miniatures pendant au moins 10 minutes. Pour l’analyse hors ligne, utilisez la dernière minute de base juste avant l’application de 4-AP, la 10ème minute de l’application 4-AP, et la 10ème minute de l’application TTX.
Dans cette expérience, le calcium extracellulaire est remplacé par du strontium pour désynchroniser la libération de vésicules synaptiques. Par conséquent, si la multiplicité est présente, cela devrait diminuer l’amplitude des courants postsynaptiques. Dans l’expérience deux, enregistrez les CPE spontanés pendant au moins cinq minutes tout en perfusant la cellule avec l’ACSF normal de calcium.
Pour désynchroniser la libération vésicule, commencer à perfuser la cellule avec strontium aCSF, et enregistrer les EPSC spontanés. Pour l’analyse hors ligne, pour déterminer si les EPSC spontanés de grande amplitude sont dus à la libération synchrone des vésicules, comparez la dernière minute de ligne de base à la 10ème minute de l’application d’aCSF de strontium. La multiplicité peut impliquer la libération multivesicular, qui cause la concentration plus élevée de neurotransmetteur dans la fente synaptique.
L’ajout de gamma-DGG, un antagoniste des récepteurs AMPA de faible affinité, conduit à une inhibition moins efficace de plus grand multiquantal par rapport aux petits courants postsynaptiques uniquantaux. Sans libération multivéhiculaire, gamma-DGG sera tout aussi efficace sur les courants postsynaptiques de plus en plus petits. Dans l’expérience trois, pour tester la libération multivesicular, enregistrez les EPSCs spontanés dans l’ACSF à faible teneur en calcium pendant au moins cinq minutes.
Ajouter 30 micromolaires 4-AP à l’aCSF par le système de perfusion. Enregistrez les CPE spontanés pendant au moins 10 minutes. Ensuite, ajoutez 200 micromolaires gamma-DGG à l’aCSF avec 4-AP, et enregistrez les EPSC spontanés pendant au moins 10 minutes.
Comme une expérience de contrôle dans une cellule séparée, répéter les procédures, mais appliquer une faible concentration de DNQX au lieu de gamma-DGG. Pour une analyse hors ligne, analyser la dernière minute de chaque demande de médicament. Les éclats d’activité synaptique peuvent augmenter transitoirement le potentiel d’action spontanée de tir et libérer la probabilité des afferents stimulés.
Si les neurones présentent une multiplicité, l’augmentation des potentiels d’action devrait provoquer une augmentation transitoire de l’amplitude des courants postsynaptiques. Dans l’expérience quatre, enregistrez les CPE spontanés dans l’ACSF normal de calcium. Pour augmenter le tir potentiel d’action, stimulez les afferents à l’aide d’une électrode de verre monopolisaire remplie d’aCSF à raison de 20 hertz pendant deux secondes, et répétez 10 fois avec un intervalle inter-rafale de 20 secondes.
Pour analyse, utilisez 5000 millisecondes d’EPSC spontanés avant le premier stimulus comme base et comparez aux CPE spontanés de 10 à 300 millisecondes après le stimulus final. Ensuite, prenez l’amplitude moyenne et le changement de fréquence sur 10 essais. Analyser les CPE spontanés et les CPE miniatures à l’aide d’un programme qui détecte et analyse les courants synaptiques.
Utilisez les paramètres de détection suggérés et la fonction d’analyse non-stop pour détecter les CPE à base de récepteurs AMPA. Numérisez manuellement chaque enregistrement pour vous assurer que le programme détecte avec précision chaque événement. Exportez les données de l’événement en les copiant sur le presse-papiers et les coller dans un logiciel de gestion de données.
Ensuite, calculez la fréquence moyenne et l’amplitude pour chaque traitement médicamenteux et effectuez les analyses statistiques pertinentes. Dans un exemple montré ici, 4-AP augmente à la fois l’amplitude et la fréquence des EPSC spontanés. L’application subséquente de TTX et de cadmium diminue à la fois l’amplitude et la fréquence.
Voici la distribution de l’amplitude spontanée epsc de l’enregistrement. Dans les neurones hypothalamiques examinés ici, l’amplitude et la fréquence des conditions de ligne de base et de TTX sont les mêmes, suggérant que les EPSC spontanés de ligne de base contiennent très peu d’EPSCs potentiel-dépendants d’action. Par conséquent, les expériences subséquentes peuvent comparer la différence entre la ligne de base et 4-AP pour mesurer la multiplicité.
La force de la transmission synaptique peut être transitoirement augmentée par des éclats d’activité synaptique. Pour étudier la multiplicité dans des conditions plus physiologiques, une stimulation afferent peut être utilisée pour augmenter la probabilité de tir potentiel d’action et de libération. Voici les résumés des changements spontanés de fréquence et d’amplitude d’EPSC suivant la stimulation synaptique.
Des enregistrements stables sont essentiels à une interprétation précise des données. Décrivez les données si la résistance à l’accès change de plus de 20 % au cours de l’enregistrement, car cela pourrait confondre l’analyse. Ce protocole offre un moyen simple d’estimer la multiplicité synaptique, qui est un déterminant clé de l’efficacité synaptique et de sa plasticité dans différentes conditions physiologiques et pathophysiologiques.
