Cet ensemble de protocoles normalise peut être utilisé pour offrir un nouvel aperçu du sulcus oculaire supérieur, ou SOS, une structure récemment découverte de l’œil en développement. Ces protocoles permettront à n’importe quel expérimentateur à travers le monde de visualiser clairement le SOS pendant le développement oculaire du poisson zèbre. Commencez par placer le facteur de différenciation de la croissance hétérozygote six Un poisson zèbre mâle et femelle sur les côtés séparés d’un séparateur dans un réservoir d’eau déchlorée la veille de leur appariement.
Le lendemain matin, retirez le séparateur et laissez le poisson se reproduire pendant au plus 30 minutes. À la fin de la période de reproduction, recueillir les embryons dans des boîtes de Pétri contenant e3 moyen pour leur incubation dans un incubateur de 28,5 degrés. À 20 heures après la fécondation, remplacer le supernatant par e3 moyen complété 0,004%1-Phenyl-2-thiourea pour prévenir la production de pigments et d’examiner les embryons par microscopie légère pour confirmer qu’ils sont tous au stade de développement approprié.
Placer les échantillons sous un microscope disséquant. Jetez tous les embryons immatures sur le plan du développement et utilisez des forceps fins pour séparer doucement les chorions. Visualisez le SOS, qui peut apparaître comme une indentation ou une ligne à la marge dorsale de l’œil.
Ensuite, trier les embryons qui montrent le retard de fermeture SOS de ceux qui ne le font pas. Pour photographier ces embryons à l’aide d’un microscope disséquant, préparez une boîte de Pétri contenant 1 % d’agarose dans le milieu E3 et piquez légèrement le centre de l’agarose pour créer un trou peu profond dans lequel le jaune de l’embryon peut être placé. Ensuite, placez un embryon anesthésié latéralement sur l’agarose.
Pour imager les embryons à l’aide d’un microscope composé ou confocal, transférez un embryon dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant un petit bolus de point de fusion non gélifié de 1 % bas surgi dans le milieu E3 et utilisez une ligne de pêche fine pour positionner rapidement l’embryon en position latérale. Lorsque l’agarose a refroidi, versez suffisamment de milieu E3 dans le plat pour couvrir l’agarose et utilisez une lentille objectif d’immersion d’eau 20x pour visualiser le SOS. Après l’imagerie, tirez doucement l’agarose de l’embryon et fixez le tissu en paraformaldéhyde de 4% ou permettez au poisson zèbre de poursuivre son développement.
Pour visualiser le SOS par expression fluorescente de l’ARNm, utilisez un appareil de microinjection pour injecter 300 picogrammes d’ARNm GFP-CAX amélioré dans des embryons au stade d’une cellule. Ensuite, utilisez un stéréoscope fluorescent pour dépister les embryons avec une expression GFP améliorée lumineuse et obtenir des images des embryons par l’une des méthodes d’imagerie comme démontré. Pour la coloration immunofluorescente de laminine embryonnaire de poisson zèbre, déchorionatez les embryons comme démontré et fixez les embryons dans un tube de microcentrifugeuse dans le paraformaldéhyde fraîchement préparé pendant deux heures sur un shaker de température ambiante.
À la fin de la fixation, laver les embryons quatre fois en PBS plus Tween, ou PBST, pendant cinq minutes par lavage suivi d’une perméabilisation de 10 microgrammes par millilitre ou de Proteinase K à température ambiante pendant cinq minutes. Lavez les embryons permeabilisés quatre fois dans PBST comme démontré et bloquez les embryons dans le sérum de chèvre de 5% et deux milligrammes par millilitre d’albumine bovine de sérum dans PBST pendant une à deux heures sur un shaker de température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, incuber les embryons dans l’anticorps anti-laminine primaire d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker.
Le lendemain matin, lavez les embryons cinq fois en PBST pendant 15 minutes par lavage et étiquetez les tissus avec un anticorps secondaire approprié pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur le shaker protégé de la lumière. Le lendemain matin, lavez les embryons quatre fois en PBST pendant 15 minutes par lavage et placez les embryons dans une petite boîte de Pétri contenant du PBST frais. À l’aide de forceps fins, perturber délicatement les jaunes et retirer les cellules jaunes par un léger grattage des sacs jaunes.
Transférer les embryons deyolked dans du glycérol fraîchement préparé à 30% dans PBS, en s’assurant de placer les embryons sur le dessus de la solution et en transférant le moins possible de la solution précédente et d’attendre que les embryons coulent au fond du tube. Lorsque les embryons ont atteint le fond du récipient, transférez-les à 50% séquentiel et 70% glycérol dans les solutions PBS, comme vient de le démontrer. Une fois que les embryons ont coulé au fond du récipient de 70% glycérol, transférez les échantillons dans un petit plat en plastique pour les dissections et séchez les embryons postérieur aux cerveaux postérieurs.
À l’aide d’outils de dissection fine, déplacez une tête vers une glissade en verre avec le moins de glycérol possible et insérez doucement une fine goupille de minutien dans le ventricule du cerveau antérieur de l’intérieur, en poussant vers le bas pour séparer les moitiés droite et gauche de la tête les unes des autres. Lorsque la tête a été complètement filetée vers le bas de la ligne médiane, monter de chaque côté de la tête midline vers le bas, côté oeil vers le haut. Le SOS est observable par le microscope disséquant à 20 à 23 heures après fertilisation et par l’imagerie différentielle de contraste d’interférence comme ligne mince dans l’oeil dorsal qui sépare les moitiés nasales et temporelles de la rétine se développante.
En outre, une indentation subtile peut être visible dans la limite dorsale de l’œil. Après la coloration immunofluorescente de la laminine, la mince ligne peut être confirmée comme membrane du sous-sol. Lorsque la fermeture sos est retardée, sa présence prolongée peut être observée comme une fente prononcée dans le côté dorsale de l’œil sous un microscope disséquant.
Lorsqu’elle est observée sous un microscope composé à l’aide d’une imagerie différentielle de contraste d’interférence, cette caractéristique est encore plus importante avec les côtés nasaux et temporels de l’œil séparés par le SOS, qui est clairement visible comme une ligne dans l’œil dorsale. Par 28 heures après la fertilisation chez le poisson zèbre de type sauvage, la coloration de laminine démontre clairement que le SOS est complètement fermé, ce qui en fait l’étape idéale pour surveiller les retards dans la fermeture des fissures. L’injection d’ARNm GFP-CAX amélioré permet la visualisation des membranes cellulaires de l’embryon vivant ou fixe pour suivre les changements dans la morphologie des cellules qui conduisent à la fermeture de SOS.
Visualiser le SOS peut être difficile, car il est étroit et transitoire. Toutefois, il est impératif que vous mainteniez une méthode de notation cohérente lors de l’évaluation des retards de fermeture à des moments ultérieurs. Ces techniques peuvent être combinées avec des manipulations expérimentales pour identifier les facteurs génétiques ou les agents pharmacologiques qui affectent la formation et la fermeture appropriées de SOS.
