Ce protocole fournit une méthode pour identifier les interacteurs d’ARN d’une protéine liant l’ARN PKR d’une manière à l’échelle du génome. Il nous aide à mieux comprendre la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes par protéine liant l’ARN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un lien croisé efficace du formaldéhyde pour fixer la RNase liée aux protéines liant l’ARN et les enrichir par immunoprécipitation.
Le PKR activé est observé chez les patients atteints d’une maladie neurodégénérative, comme la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. L’identification de la RNase à double brin qui interagit avec PKR nous aidera à mieux comprendre la pathogénie de ces maladies dégénératives. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les interacteurs d’ARN de toutes les protéines liant l’ARN.
En particulier, nous croyons que cette méthode est utile pour étudier les protéines qui reconnaissent la RNase structurée, comme la RNase à double brin. Vérifiez l’homogénéité de l’échantillon arrêté à vélo avant de récolter les cellules. En outre, il est essentiel d’optimiser l’efficacité de l’immunoprécipice en utilisant le meilleur anticorps disponible.
Pour commencer, grainez 750 000 ou un million de cellules HeLa pour des échantillons arrêtés en phase S ou M, respectivement. Cultiver des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Traiter les cellules avec de la thymidine de deux millimolaires, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 heures.
Lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez des médias frais et incubez à 37 degrés Celsius pendant neuf heures. Pour les cellules arrêtées en phase S, traiter les cellules avec de la thymidine de deux millimolaires.
Pour les cellules arrêtées en phase M, traiter les cellules avec 100 nanogrammes par millilitre de nocodazole. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 heures. Pour un échantillon de phase S, recueillir les cellules à l’intérieur d’un grattoir cellulaire et les transférer dans un tube conique de 15 millilitres.
Pour un échantillon de phase M, appuyez sur le côté du plat de culture cellulaire pour détacher les cellules arrêtées en phase M et les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifuger les cellules à 380 g à température ambiante pendant trois minutes. Retirez le supernatant et resuspendez les cellules avec un millilitre de PBS froid.
Transférer les cellules dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse les cellules à 10 000 g à quatre degrés Celsius pendant 30 secondes, et enlever complètement les supernatants. Pour effectuer le croisement de formaldéhyde, ajoutez d’abord 750 microlitres de 0,1% de paraformaldéhyde aux cellules, et incubez à température ambiante pendant 10 minutes pour fixer les cellules.
Ajouter ensuite 250 microlitres de glycine uni molaire et incuber à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires pour étancher la réaction. Centrifugeuse les cellules à 10 000 g à 4 degrés Celsius pendant 30 secondes. Retirer complètement les surnatants.
Ensuite, resuspendez avec un millilitre de PBS. Centrifuger les cellules à 10 000 g à quatre degrés Celsius pendant 30 secondes, et enlever le supernatant. Resuspendez avec 400 microlitres de tampon de lyse de fCLIP complétés avec l’inhibiteur de protéase de 0,2 pour cent de volume et l’inhibiteur de RNase de deux pour cent de volume.
Incuber sur la glace pendant 10 minutes et sonifier à l’aide d’un ultrasonicateur. Ensuite, ajoutez 11 microlitres de chlorure de sodium cinq molaires pour ajuster la concentration de chlorure de sodium à 150 millimolar, et vortex brièvement. Puis, centrifugeuse à 21, 130 g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.
Transférer les supernatants dans un tube de microcentrifugeuse pré-refroidi de 1,5 millilitre. Pour effectuer l’immunoprécipitation, ajoutez d’abord 20 microlitres de protéines A dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ensuite, lavez les perles avec 400 microlitres de tampon de lyse fCLIP.
Centrifugeuse les perles à 1000 g à quatre degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, retirez soigneusement le supernatant, ajoutez 400 microlitres de tampon de lyse fCLIP et résépendez doucement les perles en inversant trois à quatre fois. Répétez l’étape de lavage trois fois.
Après le lavage final, retirer complètement les surnatants. Resuspendez les perles dans 300 microlitres de tampon de lyse fCLIP. Ajouter 8,3 microlitres de chlorure de sodium cinq molaires pour ajuster la concentration de chlorure de sodium à 150 millimolaires.
Ajouter 10 microlitres d’anticorps activés par arn kinase protéique et incuber sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, centrifuger les perles à 1000 g à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirer le supernatant, ajouter 400 microlitres de tampon de lavage fCLIP, et resuspendre doucement les perles en inversant trois à quatre fois.
Répétez l’étape de lavage deux fois. Après le lavage final, retirer complètement les surnatants. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de lysate et incubez à quatre degrés Celsius sur un rotateur pendant trois heures.
Ensuite, centrifugez les perles à 1000 g à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirer le supernatant, ajouter 400 microlitres de tampon de lavage fCLIP, et resuspendre doucement les perles en inversant trois à quatre fois. Répétez l’étape de lavage trois fois.
Après le lavage final, retirer complètement le surnatant. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon d’élitution fCLIP. Incuber dans un ThermoMixer à 25 degrés Celsius pendant trois heures pour elute protéine kinase ARN activé à partir des perles.
Centrifugeuse à 1000 g à température ambiante, et transférer les supernatants dans un tube propre siliconisé. Enfin, ajouter 300 microlitres de Proteinase K et incuber toute la nuit à 65 degrés Celsius. L’efficacité de l’arrêt du cycle cellulaire des cellules HeLa à la phase S ou M a été examinée à l’aide du FACS.
L’anticorps D7F7 a montré une capacité supérieure à immunoprécipifier l’ARN de kinase de protéine activé. L’analyse occidentale de tache de PKR immuno précipité ou total HeLa lysate a montré seulement une bande forte correspondant à la taille de PKR, indiquant que l’anticorps de D7F7 est fortement spécifique en reconnaissant PKR. L’utilisation de différents anticorps PKR avec une efficacité de précipitation immuno différente, a entraîné une distribution différente de classe des lectures de séquençage des cartes.
La diminution du signal de radioisotope pour le RNase co-immunoprécié de PKR a été observée lors de l’enlèvement réussi de rRNA. L’échantillon co-immunoprécipité d’ARN de PKR, a montré l’enrichissement fort du RNase mitochondrial comparé aux contrôles négatifs. La transcription inverse spécifique de brin a été employée pour distinguer le RNase mitochondrial lourd et léger de brin qui ont été co-immunoprécipitaated avec PKR pour des cellules arrêtées de phase de S ou de M.
L’étape la plus critique dans la préparation de l’échantillon d’arrêt du cycle cellulaire sont où vous devez laver les cellules deux fois avec PBS et où vous devez recueillir uniquement des cellules pastel pour l’homogénéité ou serait échantillon altéré. Pour le processus éthique, les étapes les plus critiques sont le formaldéhyde crosslinking et la quantité. Après cette procédure, les ARN éluqués peuvent être analysés à l’aide d’un ballonnement nordique, d’un PCR qRT ou d’un séquençage à haut débit.
Ces expériences peuvent identifier le type et la quantité relative de RNase lié à PKR. Cette technique peut être appliquée pour étudier et identifier les interacteurs arn des protéines liant l’ARN qui amélioreront notre compréhension de la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, médiée par des protéines liant l’ARN. Le formaldéhyde est dangereux, de sorte que la fixation, la solution et le tampon de lavage initial doivent être manipulés avec prudence.
