يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي من البروتين RNA ملزمة PKR بطريقة الجينوم على نطاق واسع. يساعدنا على فهم أفضل للتنظيم بعد النسخ من التعبير الجيني عن طريق البروتين الملزم للرنا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم الربط المتبادل الفعال للفورمالديهايد لإصلاح RNase ملزمة للبروتينات RNA ملزمة وإثراء لهم من خلال المناعة.
ويلاحظ تنشيط PKR في المرضى الذين يعانون من مرض التنكس العصبي, مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر. إن تحديد RNASE المتفاعلة بين PKR وثنائية الخيوط سيساعدنا على فهم أفضل للأمراض لهذه الأمراض التنكسية. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي لأي بروتينات RNA ملزمة.
على وجه الخصوص، ونحن نعتقد أن هذه الطريقة مفيدة لدراسة البروتينات التي تعترف RNase منظم، مثل RNase مزدوجة تقطعت بهم السبل. تحقق من تجانس العينة التي تم القبض عليها من الدورة قبل حصاد الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم تحسين كفاءة المناعة باستخدام أفضل الأجسام المضادة المتاحة.
للبدء، بذور 750، 000 أو مليون خلية هيلا لعينات S-أو M-المرحلة اعتقلت، على التوالي. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. علاج الخلايا مع thymidine مليمولار اثنين، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
اغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة وسائل الإعلام الطازجة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة تسع ساعات. بالنسبة للخلايا التي تم القبض عليها من مرحلة S، عالج الخلايا التي تحتوي على thymidine من ميليمترين.
بالنسبة للخلايا التي تم القبض عليها من M-phase، عالج الخلايا التي تحتوي على 100 نانوغرام لكل ملليلتر من النوكودازول. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. للحصول على عينة من مرحلة S، قم بجمع الخلايا مع مكشطة الخلية، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
للحصول على عينة M-phase، انقر على جانب طبق ثقافة الخلية لفصل الخلايا التي تم القبض عليها من مرحلة M، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 380 غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. إزالة ناظر، وإعادة تعليق الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة.
نقل الخلايا إلى 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب. الطرد المركزي الخلايا في 10، 000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية، وإزالة المواد الفوقية تماما. لأداء الفورمالديهايد crosslinking، أولا إضافة 750 ميكرولترات من 0.1٪ paraformaldehyde إلى الخلايا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا.
ثم، إضافة 250 ميكرولترات من الجليسين واحد المولر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية لإخماد رد الفعل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 10،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية. إزالة عظمى تماما.
بعد ذلك، resuspend مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 10،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية، وإزالة فائقة. Resuspend مع 400 ميكرولترات من fCLIP تحلل العازلة تستكمل مع 0.2 حجم في المئة مثبط البروتياز واثنين من مثبطات RNase حجم في المئة.
احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة، و sonicate باستخدام أوفوق الصوتيات. بعد ذلك، أضف 11 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم الخماسي الضرس لضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملليمولار، ودوامة لفترة وجيزة. ثم، الطرد المركزي في 21، 130 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
نقل supernatants إلى ما قبل مبردة 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب. لأداء المناعة، أولا إضافة 20 ميكرولتر من البروتين الخرز في أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. ثم، وغسل الخرز مع 400 ميكرولترات من عازلة تحلل fCLIP.
الطرد المركزي الخرز في 1،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. المقبل، وإزالة عظمى، إضافة 400 ميكرولترات من عازلة تحلل fCLIP بعناية، وإعادة بلطف حبات عن طريق عكس ثلاث إلى أربع مرات. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
بعد الغسيل النهائي، إزالة االنبات تماما. Resuspend الخرز في 300 ميكرولترات من عازلة تحلل fCLIP. إضافة 8.3 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم خمسة المولار لضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملليمولار.
إضافة 10 ميكرولترات من البروتين كيناز رنا تنشيط الأجسام المضادة، واحتضان على دوار في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، الطرد المركزي الخرز في 1،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant، إضافة 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت غسيل fCLIP، وبلطف resuspend الخرز عن طريق عكس ثلاث إلى أربع مرات.
كرر خطوة الغسيل مرتين. بعد الغسيل النهائي، إزالة االنبات تماما. بعد ذلك، إضافة 300 ميكرولترات من lysate، واحتضان في أربع درجات مئوية على دوار لمدة ثلاث ساعات.
ثم، الطرد المركزي الخرز في 1،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant، إضافة 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت غسيل fCLIP، وبلطف resuspend الخرز عن طريق عكس ثلاث إلى أربع مرات. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
بعد الغسيل النهائي، وإزالة ناظر تماما. المقبل، إضافة 300 ميكرولترات من fCLIP العازلة للتقليل من الانبعاثات. احتضان في ThermoMixer في 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات لteute البروتين كيناز RNA تنشيط من الخرز.
جهاز طرد مركزي في 1،000 غرام في درجة حرارة الغرفة، ونقل super إلى أنبوب سيليكوني نظيفة. وأخيرا، إضافة 300 ميكرولترات من البروتينات K واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. وتم فحص كفاءة عملية القبض على خلايا هيلا في مرحلة S أو M باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.
أظهرت الأجسام المضادة D7F7 قدرة متفوقة على الترسب البروتين كيناز RNA تنشيط. أظهر تحليل البقعة الغربية لـ PKR المناعي المترسب أو الكلي HeLa lysate نطاقًا قويًا واحدًا فقط يتوافق مع حجم PKR ، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة D7F7 محددة للغاية في التعرف على PKR. باستخدام الأجسام المضادة PKR مختلفة مع كفاءة مختلفة مناعية لهطول الأمطار، أدى إلى توزيع فئة مختلفة من خريطة تسلسل يقرأ.
ولوحظ انخفاض في إشارة النظائر المشعة لـ RNase المُنَوَّزة بالـ PKR عند الإزالة الناجحة للرحم. PKR العينة الحمض النووي الريبي المشترك، وأظهرت إثراء قوي من RNase الميتوكوندريا مقارنة مع الضوابط السلبية. تم استخدام النسخ العكسي المحدد لـ STRAND للتمييز بين الخيط الثقيل والخفيف RNase الميتوكوندريا الذي كان مُناعيًا مشتركًا مع PKR للخلايا الموقوفة على مراحل S أو M.
الخطوة الأكثر أهمية في إعداد عينة القبض دورة الخلية هي المكان الذي يجب غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وحيث يجب جمع فقط الخلايا الباستيل للتجانس أو سيكون ضعف العينة. بالنسبة للعملية الأخلاقية ، فإن الخطوات الأكثر أهمية هي الربط المتبادل للفورمالديهايد والكمية. بعد هذا الإجراء يمكن تحليل RNAs مائل باستخدام النشاف الشمالية، qRT PCR أو تسلسل الإنتاجية العالية.
ويمكن لهذه التجارب أن تحدد نوع وكميات RNase النسبية المرتبطة بـ PKR. ويمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة وتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي من البروتينات ملزمة RNA التي من شأنها أن تعزز فهمنا للتنظيم ما بعد النسخ من التعبير الجيني، بوساطة البروتينات ملزمة RNA. الفورمالديهايد خطرة لذلك التثبيت، والحل، ومخزن الغسيل الأولي تحتاج إلى التعامل معها بحذر.
