Ce protocole utilise une méthode simple pour améliorer la fiabilité d’un modèle de culture cellulaire 3D sans l’utilisation d’un équipement spécial. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons mener l’expérience de culture 3D reproductible en contrôlant l’état de culture initial dans le dispositif cubique. Après avoir préparé un cadre cubique en polycarbonate de cinq par cinq millimètres, placez le cadre sur une glissière pré-refroidie et une boîte à glace et utilisez une pipette pour ajouter 12 microlitres de 1,5 % préchauffé s’est levé de la face supérieure du cadre cubique à la surface inférieure.
Étendre l’agarose pour obtenir une surface plane et permettre au polymère de guérir. Utilisez des pinces à épiler pour faire glisser le cadre jusqu’au bord du verre et faire pivoter le cadre de sorte que le côté ouvert soit orienté vers le bas avant de remettre le cadre sur la glissière. Après avoir rempli les deux surfaces suivantes du cadre avec plus d’agarose, comme nous venons de le démontrer, déposez l’agarose dans un récipient d’une face ouverte pour former un mur agarose sur les quatrième et cinquième côtés.
Pour mettre en place une forme initiale de cluster cellulaire injecter une matrice extracellulaire appropriée pour la culture cellulaire d’intérêt dans l’espace hybride de culture cube gel et mettre un moule micro fabriqué sur le cube. Ensuite, placez le cube dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque la matrice extracellulaire est guérie, soulevez soigneusement le moule micro afin que la matrice ne se détériore pas.
Une poche dans la forme désirée de moule sera fabriquée dans la matrice extracellulaire. Pour charger les cellules concentrer la suspension cellulaire expérimentale après centrifugation dans le milieu de culture cellulaire expérimentale approprié et injecter les cellules dans la poche dans la matrice extracellulaire. Placez le cube dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules de tomber dans la poche de matrice extracellulaire, remplissant l’espace créé par le moule micro.
À la fin de l’incubation, placer le cube dans un puits d’une plaque de puits de 24 puits et ajouter 100 microlitres du milieu de culture cellulaire approprié au puits. Injectez une matrice extracellulaire supplémentaire pour fermer la poche et remettre le cube à l’incubateur pendant 25 minutes. Lorsque la matrice extracellulaire est guérie, une chute d’environ 10 microlitres de 20 degrés Celsius s’est élevée sur la surface supérieure jusqu’au cube pour fermer la surface et guérir la chute pendant 10 à 20 minutes à 37 degrés Celsius.
Ensuite, couvrez le cube entier avec un milieu frais pour favoriser la pression osmotique pour faciliter le transfert de la nutrition vers les cellules à l’intérieur du cube. Pour la reconnaissance de la forme 3D non invasive par observation multidirectionnelle, placez la plaque sur une scène de microscope et obtenez des images de chaque côté du cube par microscopie de champ lumineux ou de contraste de phase, à l’aide d’une pince à épiler pour faire pivoter le service cube à image entre les captures. Pour l’imagerie immunofluorescente par observation multidirectionnelle, aspirez d’abord le supernatant du puits contenant le cube et fixez le cube en paraformaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante.
À la fin de la fixation, laver le cube deux fois avec du PBS pendant 10 minutes par lavage. Impermeabilize le cube avec 0,5%triton x-100 et PBS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez le cube trois fois en PBS pendant 10 minutes par lavage, avant de bloquer toute liaison non spécifique avec le sérum de chèvre et tampon d’immunofluorescence pendant 60 minutes à température ambiante.
Puis tacher les cellules avec l’anticorps primaire approprié d’intérêt selon les protocoles standard de coloration des anticorps. Puis l’image des six côtés du cube sur un microscope laser ou fluorescent comme vient de le démontrer. Dans cette expérience représentative, l’imagerie multidirectionnelle des cubes de gel hybrides, cultivés avec des cellules épithéliales bronchiques humaines normales, démontre la génération d’une culture cellulaire cylindrique ou prisme initiale par contraste de phase et imagerie immunofluorescente des cultures.
Ici, la coloration immuno des cellules épithéliales humaines normales initialement contrôlées à une forme cylindrique dans le cube de gel hybride, après génération de l’arbre bronchique est montrée. Les branches démontrent le perpendiculaire à l’axe cylindrique, comme indiqué par la formation image multidimensionnelle. Il est important d’injecter une forte densité de cellules dans la poche de matrice extracellulaire, car une faible densité de cellules peut entraîner une détérioration de cette qualité cellulaire après l’incubation.
Ce modèle de méthode est la formation reproductible d’un modèle cellulaire 3D avec une mesure quantitative par imagerie multidirectionnelle pour étudier le mécanisme du développement de plat.
