Nous avons développé un essai à haut débit pour mesurer les pièges extracellulaires neutrophiles, ou NETs. Les NET sont des structures immunogéniques de l’ADN qui sont exposées par les neutrophiles. Les NET peuvent piéger et tuer les micro-organismes et sont donc un mécanisme anti-infectieux important, mais ils jouent également un rôle pathogène dans les maladies auto-immunes.
Avec cette technique, les NETs sont quantifiés par microscopie confocative d’immunofluorescence tridimensionnelle ayant pour résultat une méthode très sensible et à haut débit pour étudier la formation et la dégradation de NET. Cette technique nous permet de quantifier la formation net des patients atteints de maladies auto-immunes. La formation ex vivo NET des patients présentant la vascularite ANCA-associée ou l’érythématose systémique de lupus pourrait être surveillée avec cet essai.
En outre, des thérapeutiques potentielles ciblant la formation d’AUT pourraient être testées avec cet essai in vitro. L’isolement des neutrophiles pourrait être une lutte pour les personnes qui n’ont jamais pratiqué cette technique auparavant. Pour commencer cette procédure, obtenez 20 millilitres de sang périphérique d’un donneur sain dans deux tubes edta-codés de 10 millilitres.
Transférer 10 millilitres de sang dans un tube stérile de 50 millilitres et pbs à un volume total final de 32,5 millilitres. À l’aide d’un contrôleur de pipette et de pipette de 10 millilitres, prenez 14 millilitres de gradient de densité. Placez la pipette sur le fond du tube de 50 millilitres.
Ensuite, sortez le contrôleur pipette de la pipette, ce qui permet au gradient de densité de s’écouler par gravité jusqu’à ce que le maximum soit atteint par effet capillaire. Placez un pouce sur la pipette pour empêcher le gradient de densité restant de s’échapper, puis retirez la pipette du tube. Centrifuger le tube à 912 fois g à température ambiante pendant 20 minutes sans accélération ni frein.
Retirez soigneusement l’anneau blanc contenant les cellules mononucléaires périphériques de sang d’abord, a suivi le plasma PBS-dilué. Enfin, retirez autant que possible la couche de gradient de densité. Ensuite, récupérez une bouteille d’eau distillée stérile froide et un flacon de PBS concentré de 10 x dans un réfrigérateur.
En travaillant rapidement, ajouter 36 millilitres d’eau directement sur le dessus de la pastille et mélanger soigneusement une fois. Après 20 secondes comptées dès le départ, ajouter quatre millilitres de 10x PBS pour faire une solution isotonique. Et encore une fois, mélanger une fois avec soin.
Centrifuger le tube à 739 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant, en vous assurant d’être extrêmement prudent car la pastille n’est pas solide, et répétez rapidement le processus d’ajout de l’eau distillée stérile froide et concentré PBS comme décrit précédemment. Centrifugeuse à 328 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en cinq millilitres de PBS. Comptez les neutrophiles et gardez-les sur la glace. Tout d’abord, faire une suspension neutrophile contenant environ 10 à 20 millions de neutrophiles en deux millilitres de PBS dans un tube de 15 millilitres.
Dans un autre tube de 15 millilitres, mélanger deux millilitres PBS avec quatre microlitres de liaison cellulaire fluorescente rouge deux micromolaires. Ajouter délicatement la solution de liaison cellulaire fluorescente rouge à la suspension du neutrophile et mélanger soigneusement. Envelopper le tube dans du papier d’aluminium pour protéger le mélange de la lumière, et incuber pendant exactement 25 minutes à 37 degrés Celsius pour étiqueter les neutrophiles avec le linker rouge fluorescent.
Inactivez l’étiquetage en ajoutant rpmi 1640 moyen contenant 10% de chaleur inactivée FCS à température ambiante à un volume final de 15 millilitres et mélanger une fois soigneusement. Si, après cela, une pastille s’est formée, suspendre soigneusement le mélange. Centrifuger le tube à 328 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.
Avant d’enlever le surnatant, assurez-vous qu’une pastille s’est formée. Après cela, re-suspendre la pastille en cinq millilitres de rouge libre RPMI 1640 moyen contenant 2%FCS à température ambiante. Ensuite, comptez les neutrophiles.
Faire une suspension cellulaire à une densité de 420.000 cellules par millilitre dans le phénol sans rouge RPMI 1640 milieu contenant 2%FCS. Ajouter 37 500 neutrophiles dans 90 microlitres à chaque puits d’une plaque noire à fond plat de 96 puits. Ensuite, ajoutez 10 microlitres du stimulus choisi en triplicate pour atteindre une concentration de 10% dans chaque puits.
Toujours inclure un contrôle négatif dans le triplicate. Incuber dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pour le temps désiré, allant de 30 minutes à deux, quatre ou six heures. Ensuite, préparez le volume de colorant imperméable à l’ADN nécessaire pour ajouter 25 microlitres de colorant d’ADN imperméable à cinq micromillons pour atteindre une concentration finale d’un micromolaire dans chaque puits.
15 minutes avant la fin du temps d’incubation, ajouter 25 microlitres de colorant imperméable à l’ADN de cinq micromolaires à chaque puits. Poursuivre l’incubation pendant les 15 dernières minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Après cela, retirez le surnatant très soigneusement et rangez-le si nécessaire.
Ajouter 100 microlitres de 4% de paraformaldéhyde. Gardez la plaque dans l’obscurité, et passez immédiatement à la section suivante. Après avoir configuré les paramètres, sélectionnez série Z.
Sélectionnez 10 comme nombre d’étapes. Sélectionnez trois micromètres comme taille d’étape. Chargez la plaque dans le microscope confocal d’immunofluorescence.
Cliquez sur l’onglet Exécuter. Remplissez le nom et la description de la plaque et choisissez l’emplacement de stockage. Sélectionnez les puits qui doivent être acquis.
Choisissez le temps d’exposition pour Texas Red et FITC. Ensuite, cliquez sur Acquire Plate et commencer l’acquisition, qui prendra environ une heure par plaque. Après cela, sélectionnez Analyse Macro.
Sélectionnez ensuite w1 et choisissez la valeur seuil. Ensuite, sélectionnez la valeur pixel désirée. Enfin, dans une deuxième fenêtre Image J, sélectionnez w2 et choisissez la valeur seuil avec la valeur pixel désirée.
Sélectionnez une destination pour le fichier de feuille de calcul, exécutez l’analyse et enregistrez le fichier journal par la suite. Présenté ici est un essai très sensible largement applicable pour la quantification semi-automatisée de la formation extracellulaire de piège de neutrophile pour l’évaluation de l’induction ex vivo des pièges extracellulaires de neutrophile sur différents stimulus. La formation de NET est quantifiée d’une manière tridimensionnelle en quantifiant l’ADN extracellulaire taché sur 10 Z-stacks avec la distance de trois micromètres commençant au plan focal dans chaque puits.
En mesurant la zone cumulative, la sensibilité de l’essai augmente. La superficie totale des neutrophiles tachés photographiés n’est quantifiée que dans le plan focal de chaque puits, ce qui correspond de façon significative au nombre total de neutrophiles dans chaque puits avec un coefficient de corrélation Pearson de 0,99. Le résultat représentatif de la quantification de la formation de NET dans les neutrophiles est exprimé comme zone cumulative tachée d’ADN extracellulaire plus de 10 Z-stacks par neutrophile imaged.
Des instantanés sont ensuite pris de l’analyse de quantification nette. Des images représentatives de neutrophiles non formulés et de NETs dans les neutrophiles stimulés par l’AAV sont montrées ici avec les neutrophiles fluorescents étiquetés en rouge et l’ADN extracellulaire taché en vert. Les neutrophiles doivent être manipulés avec soin, et l’étiquetage PKH doit être effectué exactement selon le protocole.
Cet essai peut être employé pour étudier la morphologie, la cinétique, et la composition des NETs. Cette technique est une autre méthode qui offre la possibilité d’étudier les NETs dans la santé et la maladie. Trypan bleu, PKH, et PFA doit être manipulé avec des gants et ne doit pas être respiré directement.
