Notre protocole permet aux chercheurs d’isoler les molécules de signalisation bioactives utilisées par les reptiles dans la communication chimique. Ainsi que la séparation et la purification de ces composés pour des tests supplémentaires, ou même l’identification. En utilisant cette méthode, les chercheurs peuvent obtenir une source de signaux chimiques, puis les extraire pour leur quantification ou leur utilisation de bioassay isolément.
Holly Rucker, une étudiante en thèse d’honneur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure aujourd’hui. Commencez par placer des morceaux carrés de cinq centimètres dans un récipient en verre étanche avec un couvercle compatible hexane et ajoutez suffisamment d’hexane au récipient pour submerger complètement les morceaux de peau du hangar avant de sceller le récipient. Le lendemain, utilisez des forceps métalliques propres pour enlever les morceaux du hangar, en secouant les morceaux pendant qu’ils sont capturés pour retenir tout hexane restant dans le récipient.
Pour déterminer la masse lipidique extraite transférer l’extrait à un pré pesé, flacon de fond rond et allumer la source de vide à l’évaporateur rotatif en s’assurant que la pression du vide est suffisante pour tenir le flacon au cou du condenseur. Ouvrez l’évent à l’extrémité du condenseur, faites glisser le flacon sur le cou du condenseur et fermez l’évent pour sceller le système. Après s’être assuré que le flacon ne peut pas se déconnecter du condenseur lorsque le flacon est libéré.
Abaissez le flacon jusqu’à ce que seulement le fond 10% du flacon touche l’eau dans le bain, et commencer la rotation à vitesse moyenne. Si le vide, la vitesse, le flux du condenseur et la température du bain sont optimaux, la vapeur de solvant qui quitte le flacon se condensera sur la bobine et coulera dans le flacon de récupération. Évaporer l’échantillon sous vide jusqu’à ce qu’une perle de liquide de moins d’un centimètre de diamètre soit visible au fond du flacon.
Puis éteignez la rotation et videz, et soulevez le flacon hors du bain. Tenez le cou de flacon pendant que le joint sous vide est libéré, et tordez le cou pour côté le flacon du condenseur. La perle de liquide dans l’extrait se solidifiera à mesure que l’hexane s’évaporera.
Une fois que la perle a séché à température ambiante pendant environ cinq minutes, les lipides formeront une cire blanche à jaune translucide dans le flacon. Peser le flacon pour obtenir la masse finale et solubiliser les lipides dans le volume enregistré d’hexane pour produire un milligramme ou plus de lipides par millilitre d’hexane. Pour préparer une colonne de chromatographie, utilisez une tige de cheville en bois, plus longue que la colonne pour positionner un carré de fibre de verre plié de quatre centimètres sur quatre au bas d’une colonne de chromatographie en verre.
Fixez la colonne dans un capot de fumée à un support d’anneau standard et ouvrez le robinet d’arrêt. Ensuite, versez du sable lavé et séché dans la colonne jusqu’à ce qu’environ trois centimètres de sable reposent au-dessus de la fibre de verre. Ensuite, placez du papier foncé sous la colonne et appuyez doucement dessus.
Maintenant, placez un bécher de 500 millilitres sous la colonne et mouillez lentement le sable avec environ 25 millilitres d’hexane, fermant le robinet d’arrêt quand il y a environ 0,5 centimètre d’hexane au-dessus du sable. Pour activer l’illumine neutre, pipette a déionisé l’eau d’un volume égal à 6% de la masse d’illumine en gouttes dans toute l’illumine. Et couvrez le flacon d’illumine activée, tourbillonnant vigoureusement la solution pour disperser uniformément la charge.
Lorsqu’il ne reste pas d’amas visibles d’illumine, ajouter l’hexane jusqu’à ce que l’illumine soit complètement recouverte d’environ 0,5 centimètre d’hexane. Faites tourbillonner le flacon pour former une boue et placez un nouveau bécher en verre de 500 millilitres sous la colonne. Ouvrez le robinet d’arrêt, puis faites tourbillonner l’illumine à nouveau, avant de verser régulièrement l’illumine dans un entonnoir ventilé maintenu dans le réservoir de la colonne, en prenant soin que l’illumine s’installe uniformément dans la colonne et qu’aucune grande bulle ou fissure ne se forme.
La colonne se forme lorsque le sommet de l’illumine est stable et à environ quatre centimètres sous le cou de la colonne à la base du réservoir. Ensuite, utilisez une pipette pour rincer l’intérieur du réservoir avec de l’hexane pour l’illumine résiduelle, et ajoutez doucement une deuxième couche de sable sur le dessus de l’illumine à environ un centimètre au-dessous du réservoir. Pour la fractionnement de l’extrait lipidique, utilisez une longue pipette en verre pour transférer l’échantillon lipidique à la colonne et pipette lentement l’extrait pour éviter de perturber la couche de sable.
Rincer l’extrait vile avec cinq millilitres d’hexane et transférer le lavage à la colonne. Lorsque tout l’extrait a été ajouté, ouvrez le robinet d’arrêt et laissez l’échantillon se charger dans la colonne. Une fois l’échantillon ajouté, la colonne doit rester saturée de solvant.
Si la colonne se dessèche, l’échantillon sera perdu. Placez un flacon de fond rond pré pesé et étiqueté sous la colonne pour recueillir la première fraction. Et utilisez un entonnoir en verre ventilé pour verser 100% d’hexane sur le côté du réservoir pour éviter de perturber la couche de sable.
Ensuite, ouvrez le robinet d’arrêt pour commencer l’élitution, fermant le robinet d’arrêt quand environ trois millilitres d’hexane restent au-dessus du sable au sommet de la colonne. Comme les gros animaux produisent naturellement plus de lipides cutanés en raison de leur plus grande surface totale de la peau, il est important de normaliser la masse lipidique extraite à la longueur de l’évent museau de l’animal. Une fois normalisée à la masse totale de peau de hangar, la relation linéaire de la masse lipidique extraite de peau avec la masse de la peau de hangar extraite est complètement enlevée.
Après fractionnement, la même approche de normalisation peut être utilisée avec les masses des fractions individuelles. Par exemple, ici, chaque fraction ne contribue pas également à la masse lipidique totale extraite, car les lipides neutres sont l’ensemble dominant de composés par proportion de masse, par rapport à chaque ensemble de lipides plus polaires. Si l’identification des composés est le but ultime, utilisez de la verrerie propre et vous devez éviter les plastiques pour éviter la contamination des échantillons.
Pour l’identification composée, la chromatographie liquide ou gazeuse, couplée à la spectrométrie de masse, peut être poursuivie après la collecte des échantillons. Alternativement, des bioassays peuvent être effectués pour élucider l’activité biologique de l’échantillon.
