Il s’agit d’une méthode pour appliquer la stimulation électromécanique sur les cellules. Il a de multiples applications pour étudier ses effets sur une population cellulaire, la pré-formation pour l’accouchement in vivo, et la maturation cellulaire. L’avantage est que les stimuli électriques et mécaniques peuvent être appliqués avec le même dispositif individuellement ou simultanément tout en gardant stérile virale intacte.
Cette technique est une approche indirecte de notre thérapie. La thérapie cellulaire est considérée comme des cellules électromécaniquement stimulées peut être une population cellulaire intéressante pour traiter l’intro-myocarde. Cette méthode appartient généralement au domaine cardiovasculaire, mais elle pourrait également être appliquée au système nerveux.
C’est une technique facile qui demande de la patience. La partie la plus difficile sera de travailler avec les petits morceaux, et de garder la stérilité tout au long. Il ya peu de détails de manipulation qui sont difficiles à expliquer, de sorte que la démonstration visuelle est vraiment utile.
Commencez par transférer 12 constructions PDMS nettoyées sur des plaques stériles de 10 centimètres. Pour assurer une stérilisation complète, exposez les plaques à la lumière UV pendant cinq minutes. Transférez ensuite chaque construction dans une plaque distincte de culture cellulaire de 35 millimètres, ou des plaques de 6 puits pour l’ensemencement immédiat des cellules.
Pour commencer l’ensemencement cellulaire, lavez d’abord un flacon confluent T75 d’ATDPCs cardiaques avec cinq millilitres de 1x PBS. Pour détacher les cellules, ajouter un millilitre de 0,05% trypsine-EDTA. Et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ajouter ensuite cinq millilitres de milieu complet pour inactiver la trypsine-EDTA. Recueillir toutes les cellules détachées dans un tube de 15 millilitres. Lavez le verre cellulaire deux fois avec cinq millilitres de PBS pour recueillir les cellules restantes, et ajoutez-les au tube de 15 millilitres.
Centrifugeuse à 230 g pendant cinq minutes à 22 degrés Celsius. Retirez le supernatant et suspendez les cellules en deux millilitres de milieu complet et comptez-les avec l’hémocytomètre. Semences 200 microlitres d’ATDPCs cardiaques dans chaque plaque avec le PDMS construit pour obtenir environ 80% de la surface d’ensemencement couverte par les cellules le lendemain.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Ajouter délicatement 2 millilitres de milieu complet préchauffé par assiette. Incuber les cellules avec les constructions à 37 degrés Celsius, et 5% de CO2 pendant la nuit.
Avant de commencer cette procédure, assigner six des 12 constructions pour la stimulation électromécanique, et en garder six pour les contrôles non stimulés. Utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer l’unité de stimulation. Placez l’unité de stimulation, les électrodes stériles et les pinces à épiler à l’intérieur de l’armoire d’écoulement.
Afin de manipuler facilement les électrodes et les constructions, retirez 90% du milieu de chaque plaque de culture cellulaire. Placez les constructions PDMS dans la bonne position vers l’aimant pour assurer l’attraction magnétique entre les aimants fixes et mobiles. Ces deux étapes précédentes dans lesquelles vous manipulez les constructions PDMS ensemencées de la cellule et les électrodes tout en gardant la stérilité tout au long du processus sont les plus critiques.
Ensuite, connectez le fil de platine aux connecteurs d’électrode. Orientez la partie PTFE des électrodes dans leurs espaces désignés dans les constructions PDMS. Ajouter 2,5 millilitres de milieu complet frais préchauffé à chaque construction.
Une fois que toutes les constructions PDMS sont placées et reliées électriquement à la plate-forme, placez la plate-forme dans l’incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de CO2. Puis connectez la source électrique et mécanique. Pour configurer le programme de stimulation, spécifiez les régimes de stimulation électrique et mécanique à travers les interfaces utilisateur du stimulateur électrique et de l’application, qui contrôle la stimulation mécanique.
Pour régler le synchronisme, allumez le stimulateur électrique et attendez que le menu principal apparaisse sur l’écran. Sélectionnez ensuite l’option deux, modifiez la séquence, plus Entrez. Pour modifier le menu séquence, utilisez l’onglet mode pour sélectionner le courant " en cliquant plus " et en appuyant sur Entrez " Pour la période, sélectionnez 1000"avec plus/moins et appuyez sur Entrez"Et pour l’onglet mode déclencheur, sélectionnez externe par logiciel et appuyez sur Entrez"Pour l’onglet amplitude, sélectionnez 1"avec plus/moins et appuyez sur Entrez"Puis, de retour dans le menu principal, sélectionnez l’option 4, puis générer de la séquence, puis appuyez sur Entrez"Dans la section de stimulation mécanique du panneau d’application de contrôle, d’abord écrire 1000"dans le contrôle du texte période plus.
Écrivez ensuite 500"dans le contrôle du texte de temps ON, pour définir la durée mécanique de l’impulsion. Enfin, écrivez 2000"dans le contrôle du texte d’excursion pour livrer une allongement de construction de 10%. Changez les médias cellulaires deux fois par semaine, en supprimant d’abord les anciens médias, puis en ajoutant des médias chauds et frais sur les côtés du support PDMS.
Le septième jour, à la fin de l’expérience, recueillir les échantillons tels que décrits dans le manuscrit. Les ATDPCs cardiaques électromécaniquement stimulés ont augmenté leur potentiel cardiomyogenic. Ceci a été indiqué par PCR en temps réel montrant l’expression accrue des gènes cardiaques tôt et en retard spécifiquement le facteur cardiaque de transcription GATA-4, la chaîne lourde structurale de bêta-myosine de marqueur, et le gène lié au calcium Connexin43.
La coloration de phalloidin contre des fibres d’actine a prouvé que la majorité des cellules alignées selon le modèle vertical. La distribution de Connexin43 était la plupart du temps dans le cytoplasme, et à la membrane de plasma, contribuant à la communication intracellulaire par des jonctions d’écart. Les facteurs de transcription MEF2 et GATA-4 ont été localisés aux noyaux dans les ATDPCs cardiaques.
Mais gata-4 n’a pas été détecté dans les ATDPCs sous-cutanés. Les marqueurs cytoplasmiques SERCA2, et l’alpha-actinine sarcomeric, n’ont pas montré une organisation mature de sarcomere typique pour des cardiomyocytes. Et les coups n’ont pas été observés dans le contrôle et stimulé les populations cellulaires.
Un monocouche cellulaire sain au début de ce protocole et le maintien de la stérilité tout au long de la procédure sont cruciales. Après la collecte de l’échantillon, les techniques standard d’expression des protéines du génome peuvent être effectuées. Cette technique permet de mieux comprendre l’effet des stimuli électriques et/ou mécaniques cellulaires.
Jusqu’à récemment, il était impossible d’utiliser le même dispositif pour les deux stimulations, ce qui rend les résultats plus difficiles à comparer.
