Le compteur, il est utilisé pour effectuer le séquençage efficace ChIP des protéines ester et non-ester dans le tissu lipidique brun isolé de la souris. Le principal avantage de la technique est que le protocole a été optimisé pour une immunoprécipitation efficace du complexe associé à la chromatine à partir du tissu lipidique. Avant l’incision, vaporiser la souris euthanasiée de 70 % d’éthanol.
Placez la souris avec son dos face vers le haut, puis faire une incision le long du cou. Ensuite, situé BAT directement sous la peau entre les épaules et soigneusement enlever la fine couche de graisse blanche. Relier chaque plaquette BAT en 10 millilitres de PBS contenant 1 % de formaldéhyde pendant 15 minutes à 150 rpm à température ambiante.
Après 15 minutes, étancher la liaison croisée en ajoutant 2,5 glycines molaires à la BAT, ce qui entraîne une concentration finale de 125 millimolaires. Placez-le sur un shaker pendant cinq minutes, en tournant à 150 RPM à température ambiante. Par la suite, transférez le tampon BAT à 500 microlitres de tampon de lyse hypotonique et ajoutez deux perles d’acier inoxydable pour chaque tampon BAT.
Ensuite, utilisez un homogénéisateur de tissu à base de perles pour déchiqueter le tissu. Commencez par cinq minutes à puissance maximale. Si nécessaire, prolonger le temps jusqu’à ce que le tissu soit homogénéisé et que les cellules individuelles soient séparées.
Transférer l’échantillon dans un nouveau tube et une centrifugeuse à 4 degrés Celsius à 16 000 G pendant 10 minutes. Après 10 minutes, transférer le supernatant dans un nouveau tube et garder la pastille cellulaire sur la glace. Centrifugeuse le supernatant à 4 degrés Celsius à 16 000 G pendant 10 minutes pour éviter la perte de cellules flottantes.
Ensuite, jetez le supernatant final et re-suspendre les deux granulés cellulaires ensemble dans 300 microlitres de tampon de lyse SDS avec inhibiteur une fois protéase. Incuber sur la glace pendant 10 minutes. Ensuite, soniquez les lysates pour générer des fragments d’ADN de 200 à 500 paires de base de long.
Après la sonication, enlever les débris par centrifugation pendant 10 minutes à 16 000 G à quatre degrés Celsius. Pour effectuer l’immunoprécipitation, gardez 1% de la solution de chromatine de côté comme entrée chip et gardez les entrées pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajoutez l’anticorps ChIP à un millilitre de solution de chromatine et effectuez une immunoprécipitation parallèle avec l’IgG préimmunisé correspondant ou l’IgG normal de la même espèce.
Alternativement, économisez un millilitre de solution de chromatine pour un contrôle sans anticorps. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec rotation. Pour recueillir les complexes immunitaires, ajouter 50 microlitres de protéines A agarose 50% slurry aux complexes immunitaires et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius avec rotation à 150 RPM.
Après une heure, pelleter les perles par centrifugation pendant une minute à 1000 fois G à quatre degrés Celsius. Effectuez des lavages séquentiels des perles sur des colonnes de filtre centrifuge PVDF de 0,45 micromètre avec des tampons d’une rigueur croissante en transférant d’abord les perles dans les colonnes avec 500 microlitres de tampon de lavage à faible teneur en sel. Ensuite, pelleter les perles dans les colonnes pendant trois minutes à 2500 G.Jeter le flux à travers.
Répétez le lavage avec un tampon de lavage à haute teneur en sel selon les procédures de lavage à faible teneur en sel. Ensuite, répétez les procédures avec du chlorure de lithium et enfin avec une fois TE. Une fois les lavages terminés, élitez les complexes immunitaires en ajoutant 300 microlitres de tampon d’élitution aux perles granulées dans les colonnes. Incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes sur un shaker à 400 RPM.
Par la suite, recueillir l’é elfe en tournant dans les colonnes pendant trois minutes à 2500 G dans un tube frais. Inverser les liens croisés en incubant l’é luth et les intrants recueillis à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Pour récupérer l’ADN, ajouter 300 microlitres de phénol chloroforme IAA à l’é luth et les entrées à un rapport un pour un et vortex pendant 10 secondes.
Ensuite, tournez à 21 000 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Gardez la pastille et jetez le surnatant. Lavez la pastille avec un millilitre d’éthanol froid à 70 %.
Puis tournez vers le bas à 21.000 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jeter le surnatant et sécher à l’air le granulé. Suspendre à nouveau la pastille dans 70 microlitres d’eau sans DNAse pour d’autres procédures.
Voici un exemple de PCR ChIP Q utilisant bat isolé de wildtype ou GPS2-A souris KNOCKOUT. Étant donné que le GPS2 s’est révélé nécessaire pour l’expression de gènes mitochondriaux codés nucléaires dans différentes lignées cellulaires, le recrutement de GPS2 a été testé sur deux gènes mitochondriaux spécifiques codés par le nucléaire. NDUFV1 et TOMM20 chez BAT à partir de souris comme exemples d’un tissu fortement enrichi en mitochondries.
L’occupation de promoteur de GPS2 a été comparée dans les souris de KO de GPS2-A et les compagnons sauvages de lettre de type. Une diminution prévue a été observée dans la liaison GPS2 sur les gènes cibles sélectifs dans le BAT à partir de souris KNOCKOUT GPS2-A. En utilisant le protocole décrit ici, une liaison accrue de l’ARN polymésase deux et la marque d’histone répressive, H3K9ME3, a été enregistrée dans le BAT à partir de souris KNOCKOUT GPS2-A par rapport à des compagnons lettre de type sauvage.
Ces résultats confirment le recrutement du GPS2 sur certains gènes mitochondriaux encodés nucléaires et montrent que le GPS2 est nécessaire pour prévenir l’accumulation de H3K9ME3 et donc nécessaire pour le décrochage du pôle deux activité transcriptionnelle sur les promoteurs cibles. Le protocole décrit ici, même s’il est spécifiquement optimisé pour le tissu adipeux brun, représente un outil précieux pour effectuer le ChIP à partir d’autres tissus murins et humains. N’oubliez pas que travailler avec le phénochoforme peut être extrêmement dangereux.
Par conséquent, il est extrêmement important de toujours fonctionner sous le capot de fumée tout en utilisant ce reagent.
