La pression constante à l’intérieur du dispositif de fixation maintient les poumons dans un état raisonnablement gonflé générant un spécimen histologique de poumon approprié pour évaluer l’emphysème induit par la fumée douce de cigarette. Le principal avantage de ce modèle est qu’il peut fixer de nombreux poumons en même temps en utilisant la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation. Naoko Arano, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Après avoir confirmé un manque de réponse au mouvement réflexe faire une incision dans la peau et le tissu musculaire le long de la ligne médiale de la souris, visant la région céphalique, et couper latéralement pour créer un espace de travail plus large. Après avoir exposé la ponction de la couche de diaphragme le tissu avec des forceps et ouvrir l’espace thoracique. Couper la zone sternale permettant de visualiser les poumons et le cœur.
Et couper l’oreillette gauche et le ventricule droit. Insérez une canule de calibre 24 reliée à une pompe de perfusion dans la zone ventricule droite et dirigez la canule vers la zone céphalique jusqu’à ce qu’elle atteigne l’artère pulmonaire. Ensuite, allumez la pompe et perfusez le tissu avec environ 200 millilitres de PBS pendant une heure jusqu’à ce que tout le tissu pulmonaire ait changé pour une couleur blanche.
À la fin de la perfusion couper le tissu conjonctif entourant la trachée, les poumons et le cœur, et utiliser une suture pour attacher les bronches principales droites. Ensuite, récoltez tous les lobes individuels du poumon droit et placez le cœur et les lobes du poumon gauche dans des seringues individuelles de 10 millilitres contenant un fixatif approprié. Rétractez le piston créant un vide dans la seringue pour gonfler les poumons et enlever le poumon de la seringue.
Insérez une canule de calibre 20 dans la trachée et utilisez une suture pour fixer la canule en place. Connectez une seringue d’un millilitre remplie de fixatif à la canule et remplissez le poumon d’un fixatif supplémentaire pour vérifier les fuites. Assurez-vous que le site d’insertion a été fixé pour empêcher le spécimen pulmonaire de se détacher de la planche pulmonaire pendant la fixation.
Ensuite, transférez le tissu à l’équipement de pression de fixation pulmonaire, en enlevant l’échantillon et en collant la trachée avec un noeud à la fin de la période de fixation. Le composant inférieur de l’équipement de pression de fixation pulmonaire dans lequel l’échantillon pulmonaire est inséré est relié par canule de calibre 20 à l’extrémité du flux de formaline avec un robinet d’arrêt à trois sens. La pression est générée à partir des différents niveaux de surface du fixatif entre les compartiments inférieurs et supérieurs.
La différence de pression est de 25 centimètres d’eau, mais le bouton de réglage de la hauteur peut être utilisé pour ajuster la pression à entre 25 et 30 centimètres d’eau. Une pompe relie les récipients inférieurs et supérieurs, préservant une différence de 25 centimètres dans la hauteur de surface fixative, et dirige le flux de l’agent. Après 48 heures de fixation, les poumons des souris KO SMP30 exposées à l’air ambiant ne présentent pas d’élargissement marqué de l’espace aérien.
Toutefois, l’élargissement important de l’espace aérien et la destruction des paroi alvéolaire sont observés chez les souris KO SMP30 exposées à la fumée chronique de cigarette. En outre, l’interception linéaire moyenne et l’indice destructeur des spécimens pulmonaires sont significativement plus élevés chez les souris SMP30 knockout exposées à la fumée que chez les animaux exposés à l’air. Notre laboratoire utilise 10% de formaline, mais les chercheurs peuvent utiliser d’autres agents de fixation en fonction de leurs besoins expérimentaux.
Comme nous l’avons signalé en utilisant le système de fixation démontré échantillons pulmonaires peuvent être récoltés à partir de divers modèles d’emphysème de souris pour leur évaluation morphométrique. Comme les agents de fixation peuvent être dangereux, portez toujours l’équipement de protection du personnel approprié et travaillez dans une pièce bien ventilée.
